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文檔簡介
1、目的:
自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。目前,AIH的治療主要是應用免疫抑制劑如糖皮質激素,它可單獨應用也可與硫唑嘌呤聯(lián)合應用,但這種治療方案的完全緩解率并不高,且長期服藥存在較多副作用,因此迫切需要尋找和探討新的有效治療方法。骨髓間充質干細胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是來源于骨髓中
2、的一種多能干細胞,具有多方向分化的潛能及強大的免疫調(diào)節(jié)作用,大量動物實驗和臨床研究證實BMMSCs對多種自身免疫性疾病都有很好的治療作用。本實驗以刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘導小鼠建立AIH模型,通過尾靜脈途徑移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Dil)標記的BMMSCs,觀察其在AIH中的治療效果,以及移植后細胞在肝組織內(nèi)存活、分布情況
3、,并對其可能的治療機制進行探討,為臨床BMMSCs的應用提供實驗基礎。
材料和方法:
1.小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外標記采用全骨髓貼壁法體外分離C57BL/6小鼠的BMMSCs,并進行傳代培養(yǎng)。采取第三代BMMSCs,應用流式細胞儀檢測其細胞表型,并采用茜素紅染色鑒定其骨向分化能力,以油紅0染色鑒定其脂向分化能力。體外應用CM-Dil熒光染料標記第三代BMMSCs,熒光顯微鏡下觀察細胞標記率。
4、 2.AIH模型小鼠的建立將C57BL/6小鼠隨機分為4組,分別為實驗A、B、和C組及正常對照組。A組、B組和C組分別由尾靜脈注射ConA10mg/kg-1、15 mg/kg-1和20mg/kg-1,而正常對照組由尾靜脈注射等體積的磷酸鹽緩沖液。于注射后8h取血清檢測谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平;取肝臟制作病理切片,
5、根據(jù)Knodell肝炎活動指數(shù)評分系統(tǒng)對肝組織的炎癥程度作出評分;取實驗組小鼠心、脾、肺等組織觀察有無炎癥反應。
3.BMMSCs肝組織中的分布情況及對AIH的治療效果由尾靜脈注射移植CM-Dil標記的BMMSCs,依據(jù)不同細胞量,將C57BL/6小鼠AIH模型組分為4組,尾靜脈輸注ConA,30min后移植CM-Dil標記的BMMSCs。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組和模型Ⅳ組移植的細胞量分別為1×105,5×105,1×10
6、6,1×107;而空白對照組尾靜脈輸注ConA,30min后注入等體積的磷酸鹽緩沖液。24h后處死小鼠,取血清標本檢測ALT、AST及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)及白細胞介素(Interleukin-4,IL-4)的水平;取肝組織行病理檢查其炎癥程度并作出Knodell評分;取模型組心、肝、脾、肺組織在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。
7、
結果:
1.小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)在接種48h后可見貼壁細胞,培養(yǎng)到第三代細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一,細胞排列呈束狀、漩渦狀或放射狀。流式細胞儀檢測BMMSCs的表面特異性抗原,結果顯示CD29、CD90呈陽性表達,CD34呈陰性表達;經(jīng)誘導后茜素紅染色、油紅0染色均呈陽性,符合BMMSCs的特征。體外應用CM-Dil熒光染料標記第三代BMMSCs,24h后熒光顯微鏡下觀察可見CM-Dil標記在細胞膜上發(fā)紅色熒光,且標記率
8、達90%以上。
2.給以不同劑量的ConA后,A組、B組和C組血清ALT、AST的水平及Knodell評分均明顯高于對照組(P<0.05),且隨著ConA注射劑量的增加,上述各項檢測指標均有增高(P<0.05)。實驗組小鼠除肝組織病理可見肝損害,呈炎癥改變以外,心、肺、脾未見損傷。
3.BMMSCs移植治療后,模型Ⅳ組小鼠有4只死亡,其余各組小鼠未見死亡。24h后模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清ALT、AST的水平及Kno
9、dell評分均明顯低于空白對照組(P<0.05);模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標無顯著性差異(P>0.05)。模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明顯低于空白對照組(P<0.05);模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標無顯著性差異(P>0.05)。熒光顯微鏡下在受損的肝組織內(nèi)可觀察到植入的BMMSCs,而在心、脾、肺等重要臟器并未觀察到標記的BMMSCs。
結論:
1.小鼠的BMMS
10、Cs可采用全骨髓貼壁法在體外分離、培養(yǎng)、傳代、擴增。新型熒光染料CM-Dil體外標記BMMSCs,方法簡單,標記率高,可用于BMMSCs的體內(nèi)示蹤。
2.ConA誘導制作AIH小鼠模型簡單易行,且組織損傷具有肝臟特異性,可以用于AIH的實驗研究。
3.BMMSCs對ConA誘導的AIH小鼠模型有良好的治療作用。BMMSCs可以遷移到受損的肝組織,并通過減少TNF-α、IFN-γ及IL-4等炎癥因子的分泌而避免肝細胞的
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