骨髓間充質干細胞治療小鼠自身免疫性肝炎機制探討的實驗研究.pdf

1、目的：
　　自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。目前，AIH的治療主要是應用免疫抑制劑如糖皮質激素，它可單獨應用也可與硫唑嘌呤聯(lián)合應用，但這種治療方案的完全緩解率并不高，且長期服藥存在較多副作用，因此迫切需要尋找和探討新的有效治療方法。骨髓間充質干細胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)是來源于骨髓中

2、的一種多能干細胞，具有多方向分化的潛能及強大的免疫調(diào)節(jié)作用，大量動物實驗和臨床研究證實BMMSCs對多種自身免疫性疾病都有很好的治療作用。本實驗以刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)誘導小鼠建立AIH模型，通過尾靜脈途徑移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine，CM-Dil)標記的BMMSCs，觀察其在AIH中的治療效果，以及移植后細胞在肝組織內(nèi)存活、分布情況

3、，并對其可能的治療機制進行探討，為臨床BMMSCs的應用提供實驗基礎。
　　材料和方法：
　　1.小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外標記采用全骨髓貼壁法體外分離C57BL/6小鼠的BMMSCs，并進行傳代培養(yǎng)。采取第三代BMMSCs，應用流式細胞儀檢測其細胞表型，并采用茜素紅染色鑒定其骨向分化能力，以油紅0染色鑒定其脂向分化能力。體外應用CM-Dil熒光染料標記第三代BMMSCs，熒光顯微鏡下觀察細胞標記率。
　

4、　2.AIH模型小鼠的建立將C57BL/6小鼠隨機分為4組，分別為實驗A、B、和C組及正常對照組。A組、B組和C組分別由尾靜脈注射ConA10mg/kg-1、15 mg/kg-1和20mg/kg-1，而正常對照組由尾靜脈注射等體積的磷酸鹽緩沖液。于注射后8h取血清檢測谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)水平;取肝臟制作病理切片，

5、根據(jù)Knodell肝炎活動指數(shù)評分系統(tǒng)對肝組織的炎癥程度作出評分;取實驗組小鼠心、脾、肺等組織觀察有無炎癥反應。
　　3.BMMSCs肝組織中的分布情況及對AIH的治療效果由尾靜脈注射移植CM-Dil標記的BMMSCs，依據(jù)不同細胞量，將C57BL/6小鼠AIH模型組分為4組，尾靜脈輸注ConA，30min后移植CM-Dil標記的BMMSCs。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組和模型Ⅳ組移植的細胞量分別為1×105，5×105，1×10

6、6，1×107;而空白對照組尾靜脈輸注ConA，30min后注入等體積的磷酸鹽緩沖液。24h后處死小鼠，取血清標本檢測ALT、AST及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)及白細胞介素(Interleukin-4，IL-4)的水平;取肝組織行病理檢查其炎癥程度并作出Knodell評分;取模型組心、肝、脾、肺組織在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。

7、
　　結果：
　　1.小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)在接種48h后可見貼壁細胞，培養(yǎng)到第三代細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一，細胞排列呈束狀、漩渦狀或放射狀。流式細胞儀檢測BMMSCs的表面特異性抗原，結果顯示CD29、CD90呈陽性表達，CD34呈陰性表達;經(jīng)誘導后茜素紅染色、油紅0染色均呈陽性，符合BMMSCs的特征。體外應用CM-Dil熒光染料標記第三代BMMSCs，24h后熒光顯微鏡下觀察可見CM-Dil標記在細胞膜上發(fā)紅色熒光，且標記率

8、達90％以上。
　　2.給以不同劑量的ConA后，A組、B組和C組血清ALT、AST的水平及Knodell評分均明顯高于對照組(P＜0.05)，且隨著ConA注射劑量的增加，上述各項檢測指標均有增高(P＜0.05)。實驗組小鼠除肝組織病理可見肝損害，呈炎癥改變以外，心、肺、脾未見損傷。
　　3.BMMSCs移植治療后，模型Ⅳ組小鼠有4只死亡，其余各組小鼠未見死亡。24h后模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清ALT、AST的水平及Kno

9、dell評分均明顯低于空白對照組(P＜0.05);模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標無顯著性差異(P＞0.05)。模型Ⅱ組、模型Ⅲ組小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明顯低于空白對照組(P＜0.05);模型Ⅰ組與空白對照組之間比較上述指標無顯著性差異(P＞0.05)。熒光顯微鏡下在受損的肝組織內(nèi)可觀察到植入的BMMSCs，而在心、脾、肺等重要臟器并未觀察到標記的BMMSCs。
　　結論：
　　1.小鼠的BMMS

10、Cs可采用全骨髓貼壁法在體外分離、培養(yǎng)、傳代、擴增。新型熒光染料CM-Dil體外標記BMMSCs，方法簡單，標記率高，可用于BMMSCs的體內(nèi)示蹤。
　　2.ConA誘導制作AIH小鼠模型簡單易行，且組織損傷具有肝臟特異性，可以用于AIH的實驗研究。
　　3.BMMSCs對ConA誘導的AIH小鼠模型有良好的治療作用。BMMSCs可以遷移到受損的肝組織，并通過減少TNF-α、IFN-γ及IL-4等炎癥因子的分泌而避免肝細胞的