間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的作用與機制研究.pdf

1、多發(fā)性硬化是以中樞神經系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點的自身免疫性疾病，目前尚無安全有效的治療方法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠是研究多發(fā)性硬化常用的動物模型。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有抗炎抗氧化特性，研究顯示其對多種自身免疫性疾病有治療作用。間充質干細胞具有多向分化潛能、免疫調控和自我復制等特點，對多發(fā)性硬化有潛在的治療作用。我們通過探討間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的作用和機制，為治療多發(fā)性硬化提供新的思路。本研

2、究分三部分，現(xiàn)將各部分內容概述如下。
　　第一部分：白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障完整性的影響
　　目的：研究白藜蘆醇對于實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的疾病進程緩解的機制，探究白藜蘆醇對EAE小鼠的血腦屏障完整性的影響。
　　方法：使用8-10周齡的C57BL/6雌鼠實驗，將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5mg/ml，并按1:1等體積加入完全弗氏佐劑（其中結核桿菌H37Ra終濃度為4mg

3、/ml）混合，乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱兩側分四點皮下注射，第0h及第48h腹腔注射500ng0.5ml百日咳毒素（PTX），建立EAE小鼠模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下進行。采用Knoz5分評分法對實驗小鼠臨床評分。通過50天觀察小鼠的臨床評分，來判斷EAE小鼠使用或者不使用不同劑量白藜蘆醇處理前后臨床評分情況。在免疫后21天通過小鼠尾靜脈注射伊文思藍染液后將小鼠腦組織速凍，切片拍照觀察腦部的完整性；通過免疫印跡技術檢測白藜蘆

4、醇處理后跨膜緊密連接蛋白ZO-1，occludin和claudin-5的表達情況。并同時檢測細胞間粘連分子ICAM-1和血管粘附蛋白VCAM-1的表達變化。利用實時定量PCR檢測促炎基因iNOS和IL-1、抗炎基因arginase1及NADPH氧化酶的表達；ELISA法檢測血清細胞因子IL-10水平。利用lucigenin實驗檢測NADPH氧化酶的活性，從而觀察白藜蘆醇對氧化壓力的緩解作用。
　　結果：
　　1、白藜蘆醇治療

5、能夠降低EAE小鼠的疾病嚴重性。在50天的觀察期內，使用10 mg/kg的白藜蘆醇并不能抑制疾病的發(fā)生進程，高劑量25mg/kg和50 mg/kg均能顯著的降低EAE的疾病嚴重性，使用25mg/kg和50 mg/kg的白藜蘆醇相對于PBS組的平均和最大臨床評分都顯著降低。
　　2、使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理EAE小鼠與對照組相比，可以顯著的防止伊文思藍染液進入腦部的量。而10mg/kg的白藜蘆醇效果與對照組沒

6、有顯著差異。
　　3、白藜蘆醇處理可以顯著改善EAE誘導的緊密連接蛋白的丟失。通過免疫印跡技術檢測發(fā)現(xiàn)ZO-1、occludin和claudin-5的表達在EAE小鼠中顯著降低，而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制ZO-1, occludin和claudin-5蛋白的丟失。
　　4、白藜蘆醇能夠抑制EAE小鼠腦組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的上調。免疫印跡結果顯示在EAE小鼠腦組織中ICAM-1和

7、VCAM-1蛋白表達顯著升高。而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理可以降低ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達。
　　5、在EAE小鼠中促炎基因iNOS和IL-1顯著的升高，25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制兩者的水平，而同樣在EAE小鼠中，局部的抗炎基因arginase1和細胞因子IL-10的表達輕微的上調，使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇后可以顯著上調兩者的表達，而10mg/kg白藜

8、蘆醇并不影響這兩種分子的表達。
　　6、白藜蘆醇可以顯著抑制EAE小鼠NADPH氧化酶(NOX)的表達量和活性。EAE小鼠表達有升高的NOX1、NOX2和NOX4。白藜蘆醇的處理并不影響NOX1的表達，但是可以顯著抑制NOX2和NOX4的上調，用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇同樣也可以抑制EAE小鼠中NADPH氧化酶的活性。
　　第二部分：白藜蘆醇對間充質干細胞在氧化應激和炎癥環(huán)境的保護作用
　　目的：小鼠來

9、源的間充質干細胞已經被證明對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠有一定的神經保護作用，但是由于腦脊髓炎小鼠體內的氧化應激環(huán)境和炎癥環(huán)境容易影響間充質干細胞的生物活性，進而影響干細胞的治療效果。我們通過體外實驗探討白黎蘆醇對間充質干細胞在這兩種環(huán)境下的保護作用。
　　方法：從6-8周齡的C57BL/6的腿骨中取出骨髓細胞，進行傳代培養(yǎng)，取第4代培養(yǎng)細胞用于實驗研究。使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗體標記，通過流式

10、細胞術鑒定從小鼠體內提取的間充質干細胞。骨髓間充質干細胞（mBM-MSCs）分別經過20ng/ml的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或500mM的過氧化氫（H2O2）的處理，TNF在培養(yǎng)環(huán)境中持續(xù)存在；過氧化氫處理4小時。在體外培養(yǎng)的第1，3和5天MTT法測定細胞增殖和上清液乳酸脫氫酶（LDH）測定細胞損傷；應用不同濃度的白藜蘆醇（0.1、1、10μmol/L）預處理mBM-MSCs，重復上述培養(yǎng)過程。
　　結果：
　　1、采

11、用貼壁持續(xù)培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞經流式抗體標記，鑒定后確實帶有間充質干細胞的表面標記蛋白。
　　使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗體標記，通過流式細胞術鑒定出從小鼠體內提取出的骨髓細胞經體外培養(yǎng)6周后，分離出帶有間充質干細胞表型的一群細胞亞群，而這群細胞主要是小鼠來源的間充質干細胞。
　　2、白藜蘆醇能夠降低H2O2和TNF-α誘導的細胞毒性。通過MTT檢測細胞活性并檢測上清液LDH的泄漏表明，H2O2

12、（500 mM）或是TNF-α（20 ng/mL）能夠顯著降低細胞生存并升高LDH的泄漏。而白藜蘆醇能夠降低這種細胞毒性。
　　第三部分：間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的影響
　　目的：研究間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療緩解EAE小鼠疾病進程的機制，探究聯(lián)合治療對EAE小鼠炎癥的作用。
　　方法：通過觀察小鼠的臨床評分，來判斷EAE小鼠使用間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇處理的效果。通過H&E染色和抗

13、CD4的免疫組化檢測單核細胞和T淋巴細胞對于脊髓組織的浸潤。利用ELISA檢測白藜蘆醇和間充質干細胞處理后EAE小鼠血清中Th1型細胞因子IFN-γ/TNF-α和Th2型細胞因子IL-4/IL-10的表達量。
　　結果：
　　1、間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療能夠顯著降低EAE小鼠的疾病嚴重程度。使用白藜蘆醇聯(lián)合間充質干細胞可以顯著的延緩EAE疾病進程。間充質干細胞或是白藜蘆醇治療后能夠顯著降低平均的臨床評分（PBS處理組中平

14、均臨床評分為2.63±0.42；mBM-MSCs處理組1.34±0.31；白藜蘆醇處理組1.44±0.38；PBS組與mBM-MSCs相比P<0.01；PBS組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01）和最大臨床評分（PBS組3.76±0.32；mBM-MSCs處理組1.83±0.27；白藜蘆醇處理組1.74±0.31；PBS組與mBM-MSCs組相比P<0.01；PBS與白藜蘆醇組相比P<0.01）。而兩者聯(lián)用比單獨使用效果更好（聯(lián)用的平均臨

15、床評分0.64±0.27；mBM-MSCs組與聯(lián)用相比P<0.01；白藜蘆醇組與聯(lián)用相比P<0.01；聯(lián)用最大臨床評分0.91±0.22；mBM-MSCs組與聯(lián)用組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)用組相比P<0.01）。
　　2、間充質干細胞和白藜蘆醇聯(lián)合使用可以降低EAE小鼠脊髓中的炎癥細胞數(shù)目。使用H&E染色和抗CD4的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)EAE小鼠脊髓中的炎性單核細胞和T細胞的浸潤顯著升高，而單獨使用間充質干細胞或是白藜蘆醇

16、與PBS組對比可以顯著降低浸潤細胞的數(shù)目（PBS組與mBM-MSCs處理組相比P<0.05；PBS組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01），而間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇可以更加顯著的降低炎性細胞的浸潤（mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01）。
　　3、間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇能夠促進EAE小鼠中Th1型向Th2型細胞因子的轉變。在單獨使用間充質干細胞或是白藜蘆醇處理的EAE小鼠中

17、Th1型細胞因子IFN-γ/TNF-α顯著的降低，而Th2型細胞因子IL-4/IL-10的表達量顯著升高（IFN-γ:PBS處理組與mBM-MSCs處理組P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；TNF-α:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；IL-4:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01；IL

18、-10:PBS處理組與mBM-MSCs處理組相比P<0.01；PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P<0.01）。而間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療后這種細胞因子轉換效果更加顯著。（IFN-γ:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；TNF-α:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；IL-4:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P

19、<0.05；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.05；IL-10:mBM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01；白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P<0.01）。
　　結論：
　　1、白藜蘆醇可以顯著保護EAE小鼠的血腦屏障完整性。白藜蘆醇單獨使用可以有效降低EAE疾病的嚴重性，可以顯著的防止伊文思藍染液進入腦部的量?？赡苁峭ㄟ^抑制緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的丟失，抑制EAE小鼠腦組織中上

20、調的粘附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白，抑制EAE小鼠促炎基因iNOS和IL-1的表達，上調抗炎基因arginase1和細胞因子IL-10的表達，抑制EAE小鼠NADPH氧化酶的表達量和活性來實現(xiàn)。
　　2、 H2O2或是TNF-α模擬的氧化應激和炎癥環(huán)境能夠顯著降低間充質干細胞生存并升高LDH的泄漏。白藜蘆醇能夠降低H2O2和TNF-α誘導的對間充質干細胞的細胞毒性作用。
　　3、間充質干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療可以顯著的