轉(zhuǎn)染SPK1活性的臍帶間充質(zhì)干細胞治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的實驗研究.pdf

1、目的：
　　觀察轉(zhuǎn)染鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase-1,SPHK1)活性的臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord，UCMSC)和UCMSC對多發(fā)性硬化的實驗動物模型：實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠治療效果的研究，并探討其可能的機制

2、。
　　方法：
　　采用組織塊法分離培養(yǎng)UCMSC，運用流式細胞儀檢測多種分子表面標(biāo)志，以確定分離培養(yǎng)出來的細胞符合 UCMSC細胞免疫表型，同時對 UCMSC進行相關(guān)質(zhì)控工作。攜帶SPHK1基因的腺病毒載體，滴度為1.25×1011/ml。第三代UCMSC復(fù)蘇在細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(dulbecco”s minimum essential medium,DMEM)。當(dāng)細胞長滿細胞培養(yǎng)皿3/

3、4時，更換血清濃度為5%的DMEM培養(yǎng)基，按照腺病毒滴度，每個細胞培養(yǎng)皿加入16ul攜帶有SPHK1基因的腺病毒。腺病毒刺激UCMSC48小時后收集UCMSC，然后提取蛋白。之后用westernblot實驗方法檢測UCMSC中SPHK1的表達，并和未轉(zhuǎn)染病毒的UCMSC、轉(zhuǎn)染未攜帶SPHK1基因病毒的UCMSC比較。采用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（MOG35-55）作為抗原與完全弗氏佐劑免疫 C57BL/6小鼠制作 EAE模型，UCMSC-

4、SPHK1組小鼠分別在免疫后第7、14、21、28d通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)染SPHK1活性的UCMSC（5.5×106/只，0.2 ml），UCMSC組小鼠尾靜脈注射 UCMSC（5.5×106/只，0.2 ml），對照組和EAE組注射同等體積的生理鹽水。采用臨床評分和脊髓病理切片評估各組小鼠發(fā)病情況。免疫組化方法檢測各組小鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞酸性蛋白（GFAP）、髓鞘堿性蛋白（MBP）的表達。流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細胞NK細胞、調(diào)節(jié)性T細

5、胞CD4＋CD25＋的表達變化。ELISA檢測小鼠外周血細胞因子干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素17（IL-17）和白介素4（IL-4）的含量。
　　結(jié)果：
　　采用組織塊法可方便經(jīng)濟的從臍帶中成功分離出間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測細胞表達間充質(zhì)干細胞分子表面標(biāo)志的CD44，CD29和CD105，并不表達人白細胞抗原-DR、內(nèi)皮細胞標(biāo)志的CD31和造血細胞表面抗原的CD45；分離培養(yǎng)的UCMSC沒

6、有細菌、真菌、乙肝病毒、HIV病毒和內(nèi)毒素的污染，可用于接下來的實驗。經(jīng) westernblot分析，轉(zhuǎn)染 SPHK1基因的UCMSC明顯高表達 SPHK1蛋白，而未轉(zhuǎn)染病毒的UCMSC、轉(zhuǎn)染未攜帶SPHK1基因病毒的UCMSC，SPHK1蛋白表達量明顯較低。髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（MOG35-55）與完全弗氏佐劑免疫C57BL/6小鼠成功制作 EAE模型，14天左右小鼠陸續(xù)出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀。經(jīng)尾靜脈注射干細胞治療后，UCMSC-S

7、PHK1組小鼠癥狀明顯較 UCMSC組小鼠和EAE組小鼠輕，臨床評分明顯減低。UCMSC-SPHK1組小鼠脊髓 HE染色，炎性細胞較UCMSC組小鼠和EAE組小鼠明顯減少，脊髓Fast-blue染色顯示，髓鞘脫失較另外兩組明顯減少。各組小鼠脊髓免疫組化對比表明，在GFAP的表達上，UCMSC-SPHK1組小鼠明顯少于UCMSC組和EAE組。在MBP表達上，UCMSC-SPHK1組小鼠髓鞘脫失較少，MBP表達量明顯多于UCMSC組和EAE

8、組。流式細胞術(shù)檢測顯示，UCMSC-SPHK1組小鼠脾臟淋巴細胞中，NK細胞較UCMSC組和EAE組明顯減少，而調(diào)節(jié)性 T細胞 CD4＋CD25＋的表達較上述兩組明顯增多。外周血 ELISA檢測顯示，UCMSC-SPHK1組小鼠外周血中細胞因子 IFN-γ、TNF-α和IL-17表達量較UCMSC組和EAE組減少，而IL-4的表達量較上述兩組升高。所有的實驗數(shù)據(jù)都使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，兩組間比較采用T檢驗的方法，多個樣本

9、均數(shù)之間比較采用單因素方差分析的方法。
　　結(jié)論：
　　轉(zhuǎn)染SPHK1基因的UCMSC明顯高表達SPHK1蛋白,具有SPK活性；MOG35-55與完全弗氏佐劑免疫 C57BL/6小鼠成功制作 EAE模型；經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染 SPHK1基因的UCMSC后，小鼠癥狀明顯減輕，脊髓炎性細胞明顯減少，髓鞘脫失也明顯減少，脊髓GFAP表達減少，MBP損失較少。經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染SPHK1基因的UCMSC后，小鼠脾臟中殺傷性細胞減少，而調(diào)節(jié)