間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、研究背景： 胰島移植重建胰島素分泌系統(tǒng)，是一種有望徹底根治糖尿病的治療方法。2000年，Edmonton方案的成功，標(biāo)志著胰島移植取得了突破性的進(jìn)展，從而帶動了胰島移植臨床試驗性治療在世界范圍內(nèi)廣泛展開。目前普遍認(rèn)為，解決異體移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵在于誘導(dǎo)受體對供體的細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生免疫耐受。由于移植免疫耐受的機(jī)制十分復(fù)雜，盡管誘導(dǎo)免疫耐受的方法眾多，但均未能達(dá)到完全可靠持久的特異性耐受。持久耐受狀態(tài)的誘導(dǎo)需要穩(wěn)定混合嵌合狀態(tài)的

2、長期維持，是在移植受體內(nèi)供體來源的細(xì)胞和受體細(xì)胞的共存。在嚙齒類動物體內(nèi)通常通過中樞刪除機(jī)制達(dá)到混合嵌合狀態(tài)，使能夠維持長期的器官移植免疫耐受。然而傳統(tǒng)的骨髓細(xì)胞輸注仍然無法在人體內(nèi)實現(xiàn)有效的混合嵌合狀態(tài)，且非特異性免疫抑制劑的應(yīng)用，移植物功能的慢性喪失以及潛在致命性的移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生，這些因素均限制著通過骨髓細(xì)胞嵌合體來達(dá)到器官移植耐受的臨床的應(yīng)用。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)可以從

3、成熟的骨髓、脂肪組織、胎盤、頭皮和多種胎兒組織中獲得，具有向骨組織、軟骨和脂肪等的多能分化潛能。在體外實驗中還發(fā)現(xiàn)MSC在特定的培養(yǎng)條件下能夠向肌肉、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)組織等分化，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下還可以轉(zhuǎn)分化為胰島素陽性細(xì)胞。MSC在心肌損傷的修復(fù)，骨代謝紊亂和多種代謝性疾病中顯示出很好的療效。近年來發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞還具有逃脫免疫識別和抑制免疫反應(yīng)的特性。通過阻斷共刺激通路誘導(dǎo)耐受和延長胰島移植物的存活亦受到廣泛關(guān)注，

4、抗CD154單克隆抗體在誘導(dǎo)混合嵌合體中發(fā)揮著重要的作用。它能夠有效的抑制活化的T細(xì)胞上CD40配基的表達(dá)并且阻止和抗原提呈細(xì)胞所表達(dá)受體的結(jié)合，阻止APC的上調(diào)MHC的作用，減少共刺激分子和細(xì)胞因子的表達(dá)。傳統(tǒng)的骨髓細(xì)胞移植做為誘導(dǎo)混合嵌合體和胰島移植耐受的手段的應(yīng)用已多年，并且成為最穩(wěn)定的成功措施。但是要獲得滿意的臨床療效又面臨著許多困難，諸如預(yù)處理的毒性、移植物抗宿主病和免疫低下等。 由于MSC容易從骨髓里分離和擴(kuò)增，并具

5、有逃脫免疫識別和抑制免疫反應(yīng)的特性，所以我們擬應(yīng)用糖尿病小鼠模型進(jìn)行同種異體胰島移植，抗CD154做為對受體預(yù)處理措施，并同時輸注間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，觀察其對同種異體小鼠胰島移植誘導(dǎo)混合嵌合狀態(tài)，及對胰島移植物存活時間的影響。 目的： 觀察MSC聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注對同種異體小鼠胰島移植誘導(dǎo)混合嵌合狀態(tài)，及對胰島移植物存活時間的影響，為尋找誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的方法開辟新的途徑、提供新的依據(jù)。 方法： 1

6、、MSC分離培養(yǎng)、擴(kuò)增分別取C57BL/6小鼠和KM小鼠頸椎脫臼處死，用L-DMEM培養(yǎng)基沖洗出股骨內(nèi)的骨髓，首次24h換液后每3d換液，依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和擴(kuò)增MSC，取第4代細(xì)胞作為移植供源，調(diào)整細(xì)胞數(shù)2×106/ml。 2、供體骨髓細(xì)胞制備取出C57BL/6小鼠雙側(cè)股骨，用培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，通過200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集后加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，離心去上清，再洗滌兩次用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞調(diào)整8×107/ml備用。

7、 3、小鼠糖尿病模型的建立和胰島移植STZ(180mg/kg)經(jīng)腹腔一次性注射BALB/C小鼠，制備實驗性糖尿病模型(連續(xù)2次血糖>16.7mmol/L)；造模成功后的小鼠經(jīng)脊柱旁切口暴露左側(cè)腎臟，注入腎包囊下約500IEQ胰島。移植后1周每天監(jiān)測隨機(jī)血糖，以后隔日測1次血糖，連續(xù)兩次血糖水平大于11.1mmol/L，以第1次時間認(rèn)為排斥反應(yīng)發(fā)生。 4、小鼠胰島細(xì)胞的分離純化摘取4只C57BL/6小鼠的胰腺，0.25mmPen

8、fine針對胰腺反復(fù)多點注射膠原酶P后靜止消化20min；采用自制的推進(jìn)式離心管，以單一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)純化胰腺消化物，雙硫腙對胰島進(jìn)行特異性染色，利用胰島素釋放試驗檢測胰島細(xì)胞的功能；純化后的胰島移植到實驗性糖尿病BALB/C小鼠的腎包囊下，術(shù)后觀察其血糖變化。 5、實驗分組和處理近交系C57BL/6小鼠(H-2Kd)和BALB/C小鼠(H-2Kb)分別為供體和受體，無關(guān)第三品系KM小鼠。A組：對照

9、組(單純進(jìn)行胰島移植)；B組：供體MSC輸注；C組：供體骨髓細(xì)胞輸注；D組：供體骨髓細(xì)胞和MSC輸注；E組：供體骨髓細(xì)胞和第三品系的KM小鼠MSC輸注。每組各5只，均在胰島移植術(shù)后經(jīng)小鼠尾靜脈輸注上述細(xì)胞懸液。所有受體小鼠在胰島移植的同時腹腔注射500μg抗CD154單抗。 6、供體細(xì)胞嵌合率檢測移植后的第7、30、60d眼球采血100μl肝素抗凝后，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心移去上清。按1μg/106細(xì)胞加入FITC-H

10、-2Kb單抗，充分混勻后置4℃冰箱避光染色15-30min，PBS洗滌2次，加入PBS500μl重懸成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測。規(guī)定當(dāng)嵌合率低于1％時表示混合嵌合狀態(tài)的結(jié)束。 7、對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響按上述A、C、D各組的分組和處理措施進(jìn)行胰島移植，糖尿病BALB/C小鼠分別于胰島移植術(shù)后7、30、60d取脾臟分離淋巴細(xì)胞，與ConA處理的供體C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細(xì)胞增殖

11、反應(yīng)。 結(jié)果： 1、MSC生長情況原代培養(yǎng)24h換液，可見少量貼壁細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則。原代及傳代培養(yǎng)的小鼠MSC多呈梭形，部分呈不規(guī)則樣，可見較多集落形成。培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形、星形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)豐富，核仁明顯，細(xì)胞平行排列或漩渦狀生長。 2、純化單一密度梯度液純化后，共可得到(789.6±26.4)IEQ胰島，平均純度為(77.12±3.23)％。高糖刺激后胰島素釋放量為低糖的2.35倍[分

12、別為(12.72±1.08)μIU/ml和(5.41±0.53)μIU/ml,P<0.010]，提示胰島β細(xì)胞功能良好。 3、C組(53.00±12.98d)與A組(13.00±3.21d)相比胰島移植物存活時間顯著延長，表明單純骨髓細(xì)胞輸注能顯著減少排斥反應(yīng)。D組胰島移植物生存時間(77.00±8.23d)與C組相比均有顯著延長(p<0.010)，E組移植物生存時間(61.00±5.98d)與A、C兩組相比也有顯著性差異(P<

13、0.010)，說明MSC輸注均能有效的延長骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的移植免疫耐受。D組比E組移植物生存時間延長(P<0.050)，供體來源的MSC比其它來源的MSC更有效的延長移植物存活時間。B組移植物生存時間(15.00±6.19d)與A組相比沒有顯著性差異，單純MSC輸注并不能使移植物存活時間延長。 4、胰島移植后第7d，單純胰島移植組和MSC輸注組的DC水平都很低；其余三組均達(dá)到了混合嵌合體的水平。胰島移植后第30d，BMC輸注組DC

14、從(28.84±4.78)％下降到(15.26±2.31)％，其中1只小鼠的胰島功能喪失；而BMC和MSC同時輸注的D組和E組，DC下降不明顯，始終維持在25％以上，與C組相比差距有顯著意義(P<0.010)。移植后60d，C組DC只有(2.16±0.68)％，80％的胰島功能喪失；此時E組[(7.66±2.01)％]與D組[(13.50±2.25)％]的供體細(xì)胞嵌合率比較差距有顯著意義(P<0.010)，E組2只小鼠胰島功能喪失。隨時

15、間的延長受體體內(nèi)的DC逐漸下降，同時輸注MSC的D組比單純輸注BMC的C組下降趨于緩和。 5、混合輸注的D組在移植后30dBALB/C小鼠淋巴細(xì)胞對ConA處理的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，較接受單純骨髓細(xì)胞輸注組明顯降低(P<0.010)，直至移植后60d抑制效應(yīng)仍為顯著。 結(jié)論： 1、貼壁法和連續(xù)傳代法相結(jié)合是一種簡單、有效和經(jīng)濟(jì)的分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 2、改進(jìn)的Penfine針對胰

16、腺反復(fù)多點注射和采用自制的推進(jìn)式離心管以單一密度梯度Ficoll液純化胰腺消化物，所得胰島功能良好，大大簡化了傳統(tǒng)的對小動物進(jìn)行胰島分離純化的繁瑣程序，提高了成功率。 3、MSC聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注比單純骨髓細(xì)胞輸注能夠更長時間的維持混合嵌合狀態(tài)，使胰島移植物存活時間延長。 4、供體來源的MSC輸注比非供體來源的MSC輸注有更有效的免疫抑制作用。 5、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實驗證實，混合輸注組的受體鼠淋巴細(xì)胞對供體淋巴