骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰島移植中潛在作用的研究.pdf

1、第一部分 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰島移植中的潛在作用。 方法：(1)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；構(gòu)建經(jīng)濟(jì)，高效，穩(wěn)定的小鼠胰島分離純化方法和胰島移植模型。 (2)從BALB/c小鼠骨髓分離培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，分離純化BALB/c小鼠胰島，將邊緣數(shù)量的胰島和間充質(zhì)干細(xì)胞混合后移植到鏈脲佐菌素造模的BALB/c小鼠腎包膜下。移植后監(jiān)測(cè)血糖、體重變化，移植滿一個(gè)月后行腹腔糖耐量試驗(yàn)，切除移植腎臟行免

2、疫組化檢測(cè)。(3)分別從BALB/c小鼠和ICR小鼠骨髓分離培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，將足量的ICR小鼠胰島分別和BALB/c來(lái)源及ICR來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合后移植到鏈脲佐菌素造模的BALB/c小鼠腎包膜下。移植后監(jiān)測(cè)血糖、體重變化，出現(xiàn)排斥反應(yīng)后切除移植腎臟行免疫組化檢測(cè)。 結(jié)果：(1)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后能夠向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD34、CD45、CD90陽(yáng)性率分別為93.8

3、6±1.12％，0.48±0.38％，1.89±1.49％，94.11±3.32％；采用淋巴細(xì)胞分離液和Histopaque均能純化出得率穩(wěn)定、活性良好的胰島，移植后均能逆轉(zhuǎn)造模糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)并長(zhǎng)期維持。 (2)在近交系小鼠，聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能使胰島移植的成功率明顯升高(71.4％vs 42.9％，P<0.05)，移植后血糖、體重及糖耐量均明顯改善，切除移植腎后血糖明顯升高，腎包膜下胰島素染色強(qiáng)陽(yáng)性，單純移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、組亦未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)分化形成的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。 (3)在非近交系小鼠，無(wú)論是聯(lián)合供體還是受體來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植均未能明顯延長(zhǎng)血糖維持正常的時(shí)間(P>0.05)，腎包膜下可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島素染色較弱，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自身能在腎包膜下存活較長(zhǎng)時(shí)間。 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠保護(hù)同基因移植的胰島功能，減少一次成功移植所需要的胰島數(shù)量。但本實(shí)驗(yàn)未能觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在異基因胰島移植中有明確的保護(hù)作用。 第二部分

5、 目的：建立一種高效，穩(wěn)定的從小鼠骨髓同時(shí)分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。 方法：從小鼠骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁結(jié)合專用血清或特殊培養(yǎng)基分別擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞。以成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞純度；以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1熒光雙標(biāo)，結(jié)合vWF、CD3免疫組化染色鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，并計(jì)算其純度。 結(jié)果：早期貼壁細(xì)胞48小時(shí)換液時(shí)即可

6、見(jiàn)明顯集落形成，1周后即達(dá)80％融合，傳至第三代后經(jīng)誘導(dǎo)能夠向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD34、CD45、CD90陽(yáng)性率分別為93.86±1.12％，0.48±0.38％，1.89±1.49％，94.11±3.32％；二次貼壁細(xì)胞經(jīng)EGM-2 MV專用培養(yǎng)基培養(yǎng)后，第3天開(kāi)始伸展，第5天可見(jiàn)集落形成，約2周左右可融合近80％，傳代后Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙熒光染色陽(yáng)性率75.2±4.5％，CD

7、31、vWF免疫組化染色陽(yáng)性率分別為55.7±4.7％和52.5±3.6％。 結(jié)論：采用該方法可以用一只小鼠同時(shí)培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞，效率高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。 第三部分 目的：探討不同密度梯度分離液對(duì)小鼠胰島分離數(shù)量和質(zhì)量的影響，構(gòu)建經(jīng)濟(jì)，高效，穩(wěn)定，重復(fù)性好的小鼠胰島分離純化方法和近交系移植模型。 方法：采用膽管內(nèi)膠原酶灌注結(jié)合密度梯度離心法分離純化小鼠胰島，在供體體重、膠原酶

8、濃度、消化時(shí)間、溫度和胰島培養(yǎng)時(shí)間一定的情況下，比較國(guó)產(chǎn)人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll和進(jìn)口Histopaque在胰島分離數(shù)量及移植效果上的差別。借助體視顯微鏡，手挑計(jì)數(shù)分離胰島數(shù)量，通過(guò)腎包膜下移植評(píng)價(jià)分離胰島的功能。 結(jié)果：淋巴細(xì)胞分離液組和Histopaque組的胰島得率無(wú)顯著差別(136.5±23.47 vs 142.8±17.65個(gè)；P>0.05)。接受胰島移植的鏈脲佐菌素造模近交系小鼠均能迅速逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)，且維持達(dá)1

9、00天以上，提示胰島具有良好的功能。 結(jié)論：采用國(guó)產(chǎn)人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll純化的小鼠胰島在數(shù)量及移植效果上和Histopaque均無(wú)明顯差異，完全可以替代后者用于胰島移植。 第四部分 目的：明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)同基因胰島移植有無(wú)保護(hù)作用。 方法：從BALB/c小鼠骨髓分離培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，分離純化BALB/c小鼠胰島，將邊緣數(shù)量的胰島和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合后移植到鏈脲佐菌素造模的BALB/c小

10、鼠腎包膜下。移植后監(jiān)測(cè)血糖、體重變化，移植后滿一個(gè)月行腹腔糖耐量試驗(yàn)，切除移植腎臟行免疫組化檢測(cè)。 結(jié)果：聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞使胰島移植的成功率明顯升高(71.4％vs42.9％，P<0.05)，移植后血糖、體重及糖耐量均明顯改善，切除移植腎后血糖明顯升高，腎包膜下胰島素染色強(qiáng)陽(yáng)性，但血管內(nèi)皮染色不明顯，單純移植間充質(zhì)干細(xì)胞組亦未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠保護(hù)移植胰島的功能，減少一次

11、成功移植所需要的胰島數(shù)量。但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 第五部分 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在異基因胰島素移植中的潛在作用。 方法：分別從雄性BALB/c小鼠和ICR小鼠骨髓分離培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，將足量的ICR小鼠胰島分別和BALB/c來(lái)源及ICR來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合后移植到鏈脲佐菌素造模的BALB/c小鼠腎包膜下。移植后監(jiān)測(cè)血糖、體重變化，出現(xiàn)排斥反應(yīng)后切除移植腎臟行免疫組化檢測(cè)。 結(jié)果：無(wú)論是聯(lián)