白藜蘆醇苷對大鼠鞘內(nèi)注射羅哌卡因神經(jīng)毒性的影響.pdf

1、目的： 局麻藥(localanesthetics，LA)系臨床麻醉常用的藥物，其具有直接或間接的周圍神經(jīng)毒性作用，臨床表現(xiàn)分為永久性和短暫性的神經(jīng)損傷。目前關(guān)于LA周圍神經(jīng)毒性損傷機理尚未完全清楚，較肯定的為其與LA的濃度、劑量、腦脊液中的濃聚、神經(jīng)系統(tǒng)暴露于LA的時間等密切相關(guān)。就此LA周圍神經(jīng)毒性損傷途徑而言，臨床已采取相應(yīng)防治措施，但并未取得確切效果，且無流行病學(xué)資料證明可降低其發(fā)生率。因而近年國內(nèi)外學(xué)者研究探討應(yīng)用藥物防

2、治LA對周圍神經(jīng)的毒性作用。 鑒于上述現(xiàn)狀，藥物防治LA周圍神經(jīng)毒性損傷成為關(guān)注的焦點。綜合文獻報道，目前正在研究的藥物主要分為四大類：①神經(jīng)營養(yǎng)因子。該領(lǐng)域研究僅局限于離體細胞培養(yǎng)實驗階段，并顯示出一定的神經(jīng)保護作用，但在體實驗?zāi)芊癯霈F(xiàn)同樣的結(jié)果，前景不明。②興奮性氨基酸谷氨酸受體拮抗劑。在體及離體實驗結(jié)果證實，其主要通過拮抗a-氨基羥甲基惡唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-pro

3、pionicacid，AMPA)受體發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但并不能完全消除神經(jīng)毒性損傷。③絲裂原性活化蛋白激酶抑制劑(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)。MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶大家族，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinases，ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-teminalkinases，JNKs)和p38激酶。部分

4、學(xué)者通過探討LA周圍神經(jīng)毒性損傷與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LA可通過誘導(dǎo)MAPK相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，同時發(fā)現(xiàn)p38激酶抑制劑對利多卡因所致神經(jīng)毒性損傷具有神經(jīng)保護作用，減少神經(jīng)細胞凋亡。④中草藥類。國內(nèi)學(xué)者經(jīng)離體脊髓神經(jīng)元細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)參附注射液對布比卡因引起的神經(jīng)毒性具有一定的保護作用，然而機理不清，且在體實驗保護效果如何，尚無實驗研究予以證實。 白藜蘆醇苷(polydatin，PD)為天然白藜蘆醇(resve

5、ratrol，Res)的葡萄糖苷形式，前者在體內(nèi)水解為Res而發(fā)揮藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)Res可減輕外傷性脊髓損傷，促進神經(jīng)再生及功能恢復(fù)。Res上述作用可否應(yīng)用于防治LA引起的周圍神經(jīng)毒性損傷，尚無研究證實。 本實驗采取大鼠靜脈注射高純度中藥單體PD，通過感覺、運動功能評分與光鏡組織形態(tài)學(xué)觀察，初步判斷其對大鼠鞘內(nèi)注射2％羅哌卡因引起的神經(jīng)毒性損傷是否具有保護效應(yīng)。 方法： 1、制備SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔給藥模型

6、 成年SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛(100mg/kg)麻醉。將PE-10導(dǎo)管消毒封存?zhèn)溆?。大鼠取俯臥位，于背部正中線L3～L4間隙處作長約2cm的皮膚縱切口，暴露上、下關(guān)節(jié)突間黃韌帶。提起下位棘突，以7號針頭探查，穿破黃韌帶、硬脊膜及蛛網(wǎng)膜，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)擺或后腿抽動為成功標志。經(jīng)破口向尾側(cè)置入PE-10導(dǎo)管2cm，固定、縫扎導(dǎo)管。導(dǎo)管置于皮下，縫合切口。大鼠術(shù)畢肌注青霉素鈉，注意保溫，單籠飼養(yǎng)2d，每日檢查有無脊髓神經(jīng)損傷及局部

7、感染表現(xiàn)，如出現(xiàn)感覺與運動異常表現(xiàn)，則予以剔除。 2、實驗分組 選取鞘內(nèi)置管成功大鼠50只，隨機分5組(n=10)。NS組經(jīng)PE-10導(dǎo)管鞘內(nèi)注入生理鹽水4μl(對照組)；R組鞘內(nèi)注入2％羅哌卡因40μl；R+PD1、R+PD2、R+PD3組分別經(jīng)股靜脈注射PD(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg)，容量均為0.75ml/100g，其后鞘內(nèi)注射2％羅哌卡因40μl。各組大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈穿刺置管持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓

8、(meanarterialpressure，MAP)，若MAP<60mmHg，可經(jīng)股靜脈緩慢靜滴0.9％生理鹽水補液。 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，各組大鼠體重、蛛網(wǎng)膜下腔置管時間以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，組內(nèi)比較采用完全隨機設(shè)計資料的單向方差分析(One-wayANOVA)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3、給藥后7d大鼠行感覺、運動功能評分 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處

9、理，各組感覺、運動功能評分比較均采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallistest)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。感覺與運動功能評分組間兩兩比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU-test)，并采用Bonferroni法校正檢驗水準α，校正后的檢驗水準為α=0.005，P≤0.005為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、灌注固定、取材、光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)改變 大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，鞘

10、內(nèi)注射6μl亞甲藍以確認導(dǎo)管尖端位置。開胸，暴露心臟，灌流針于左心室穿刺至升主動脈，先以37℃的生理鹽水300ml沖灌，直至體循環(huán)血液沖洗干凈，流出清亮的灌流液為止。換冷(4℃)4％多聚甲醛(0.1mol/L，pH7.35)500ml灌流固定40min～1h。于置管位置以蚊鉗咬開椎板，分離尾段脊髓(脊髓圓錐以上)及10mm馬尾神經(jīng)(脊髓圓錐以下)固定于4％多聚甲醛中24h，再置于脫鈣液中24h。行石蠟切片，蘇木素-伊紅(Hematoxy

11、linandEosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓、神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)等組織結(jié)構(gòu)改變并進行損傷評分。 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，各組損傷評分比較采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallistest)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。損傷評分組間兩兩比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU-test)，并采用Bonferroni法校正檢驗水準α，校正后的檢驗水準為α

12、=0.005，P≤0.005為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、所有實驗大鼠體重(227±12)g，P=0.996(P>0.05)，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2、所有大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù)手術(shù)時間為(30±4)min，P=0.427(P>0.05)，各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。手術(shù)切口局部無感染。每日觀察未見脊髓神經(jīng)損傷表現(xiàn)。 3、大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注射給藥的可靠性 (1)鞘內(nèi)注射6μl亞甲藍，打開椎管，暴露脊

13、髓，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管均位于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)。 (2)鞘內(nèi)注射2％羅哌卡因4μl，大鼠全部出現(xiàn)雙下肢麻痹，鉗夾雙上肢躲避反射存在，而雙下肢無反應(yīng)，夾尾反射消失，證明藥物已在脊髓起作用。 4、大鼠鞘內(nèi)給藥后MAP均顯著下降，但均高于60mmHg，未行靜脈補液。大鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)。 5、各實驗組大鼠給藥后第7d，感覺功能評分平均秩次R組>R+PD1組>R+PD3組>R+PD2組>NS組，采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-

14、Wallistest)，P=0.000，各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進一步組間多重比較(Mann-WhitneyU-test)，發(fā)現(xiàn)NS與R、NS與R+PD1、R與R+PD2、R+PD1與R+PD2之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)，其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.005)。即NS組感覺功能評分低于R及R+PD1組。R+PD2組感覺功能評分低于R、R+PD1組。 6、各實驗組大鼠給藥后第7d運動功能評分未見

15、明顯改變。 7、光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠鞘內(nèi)注射2％羅哌卡因神經(jīng)毒性損傷的主要部位為脊髓白質(zhì)背索、脊神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)。輕度損傷可見局部水腫，重者可見神經(jīng)軸突退行性變，包括軸突腫脹空泡化，萎縮，軸突消失，甚至巨噬細胞浸潤。脊髓灰質(zhì)前角運動神經(jīng)元改變并不明顯，局部少許可見神經(jīng)元染色質(zhì)溶解，未出現(xiàn)特征性的脊髓前角運動神經(jīng)元的改變。 8、各實驗組大鼠神經(jīng)損傷評分平均秩次R組>R+PD1組>R+PD3組>R+PD2組>NS組，采用多個

16、獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallistest)，P=0.000，各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進一步組間多重比較(Mann-WhitneyU-test)，發(fā)現(xiàn)NS與R、NS與R+PD1、R與R+PD2、R與R+PD3、R+PD1與R+PD2之間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)，其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.005)。即NS組神經(jīng)損傷評分低于R、R+PD1組，R+PD2組神經(jīng)損傷評分低于R、R+PD1組，R+

17、PD3組神經(jīng)損傷評分低于R組。 結(jié)論： 1、成功制備大鼠鞘內(nèi)給藥動物模型。改進的大鼠蛛網(wǎng)膜下腔給藥模型置管成功率高，損傷小，未發(fā)生脫管，為下一步實驗奠定了良好的基礎(chǔ)。 2、大鼠鞘內(nèi)注射2％羅哌卡因神經(jīng)毒性損傷明確。損傷部位主要累及脊髓白質(zhì)背索、脊神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)，而脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元、背根神經(jīng)節(jié)等未見明顯改變。光學(xué)顯微鏡下觀察主要表現(xiàn)為局部充血水腫，神經(jīng)軸突退行性變，即軸突腫脹空泡化、萎縮、軸突消失、甚至巨噬細胞浸潤