2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥系其全身毒性的常見(jiàn)毒副反應(yīng)。由于嬰幼兒特殊的解剖和發(fā)育特點(diǎn),局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥在嬰幼兒中更為常見(jiàn)。有研究證實(shí)在幼年時(shí)期經(jīng)歷長(zhǎng)程或反復(fù)驚厥,對(duì)其中樞神經(jīng)突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶有影響。
   嬰幼兒或幼年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育處于突觸爆發(fā)期,是神經(jīng)細(xì)胞快速分化、遷徙、樹(shù)突快速形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵時(shí)期,此期對(duì)各種傷害性刺激抵御能力差,易對(duì)其中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育和功能形成產(chǎn)生影響。眾多研究報(bào)道其它非局麻藥因素致發(fā)育期反復(fù)

2、或長(zhǎng)程驚厥可導(dǎo)致動(dòng)物成年認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力下降,其機(jī)制與離子通道、氨基酸受體、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的蛋白質(zhì)合成、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。局麻藥致發(fā)育期嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性驚厥,是否會(huì)對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成損害,對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的形成是否有影響尚無(wú)研究定論。
   早在上世紀(jì)20年代已有關(guān)于局麻藥中樞神經(jīng)毒性的相關(guān)報(bào)道。此后麻醉領(lǐng)域?qū)W者們展開(kāi)了大量關(guān)其機(jī)制和防治的研究。局麻藥中樞神經(jīng)毒性以驚厥發(fā)作為主要臨床表現(xiàn),其

3、機(jī)制主要與興奮性—抑制性氨基酸學(xué)說(shuō)、NMDA-Ca2+-NOS通路學(xué)說(shuō)、多巴胺、乙酰膽堿、M型鉀通道等有關(guān)。而以上受體、神經(jīng)遞質(zhì)、及離子通道等均不同程度參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)突觸發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶能力的形成。海馬作為與學(xué)習(xí)記憶最為相關(guān)的解剖部位,也是局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥的發(fā)生形成關(guān)鍵部位。
   學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)神經(jīng)功能。學(xué)習(xí)和記憶是兩個(gè)相互聯(lián)系和影響的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程,學(xué)習(xí)是指人或生物依賴經(jīng)驗(yàn)來(lái)改變自身環(huán)境的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程,而記憶則

4、是將通過(guò)學(xué)習(xí)得到的信息儲(chǔ)存和輸出的一種神經(jīng)活動(dòng)。學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高度可塑性,包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接形態(tài)及與神經(jīng)突觸發(fā)育相關(guān)的各種神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白、離子通道、受體等多種不同層次不同階段的可塑性。而其中突觸連接是神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵部位,也是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元之間傳遞信息、實(shí)現(xiàn)生理功能的關(guān)鍵部位。
   突觸可塑性是指在外環(huán)境改變時(shí),神經(jīng)元突觸發(fā)生適應(yīng)性改變從而維持其相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),包括形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上的改變。研究認(rèn)為在反復(fù)或長(zhǎng)程驚厥

5、后,海馬突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞,從而影響學(xué)習(xí)記憶的維持和神經(jīng)功能的發(fā)揮,其破壞程度與學(xué)習(xí)記憶功能的減退呈正相關(guān)。以往局麻藥中樞神經(jīng)毒性研究發(fā)現(xiàn),局麻藥抑制突觸軸突生長(zhǎng),并減弱神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo),從而削弱了突觸維持正常生理功能的能力。突觸素是一種鈣結(jié)合糖蛋白,特異性位于軸突末梢的突觸前膜上。突觸素參與谷氨酸、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過(guò)程,與突觸可塑性關(guān)系密切。突觸素作為突觸囊泡的一種特異性標(biāo)志蛋白,其密度和分布可間接反應(yīng)單位體積內(nèi)突觸數(shù)

6、量和分布情況,與突觸重建及認(rèn)知過(guò)程密切相關(guān)。另一方面突觸素調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育及成熟,還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白組裝而影響神經(jīng)元的分化。突觸素在神經(jīng)軸突延伸、突觸連接形成和突觸成熟中具有重要的意義。
   鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulindependentproteinkinaseⅡ,CaMKⅡ)CaMKⅡ是海馬內(nèi)含量最高的一種蛋白質(zhì),是鈣離子的主要結(jié)合蛋白,且與突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)密切相關(guān),有“學(xué)習(xí)記

7、憶分子開(kāi)關(guān)”之稱。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein,CREB)CREB是一種真核生物細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能,是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵成分之一。研究發(fā)現(xiàn)CREB在長(zhǎng)期記憶的維持中起關(guān)鍵作用。在以往對(duì)可卡因急性或反復(fù)應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn),可卡因通過(guò)影響CREB磷酸化,對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響。Ca2+-CaMKⅡ-CREB通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記

8、憶能力形成與維持的主要信號(hào)通路之一。以往研究發(fā)現(xiàn),利多卡因、可卡因、普魯卡因抑制海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),與影響鈣調(diào)素有關(guān)。局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥時(shí)引發(fā)鈣超載,嚴(yán)重鈣超載與CaMKⅡ、CREB之間影響如何?是否會(huì)對(duì)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響目前尚不明了。
   本課題通過(guò)測(cè)定0.5%羅哌卡因致幼鼠(P21日齡)中樞神經(jīng)毒性驚厥ED95值,分別制備幼鼠單次驚厥和反復(fù)驚厥實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。?yīng)用Morris水迷宮測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠驚厥后近期及成年后學(xué)習(xí)記憶能

9、力變化;采用透射電鏡觀察中樞神經(jīng)毒性驚厥后實(shí)驗(yàn)鼠在不同時(shí)間海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化;以免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot免疫印跡技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)突觸素蛋白的表達(dá);應(yīng)用WesternBlot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達(dá)水平變化。本研究從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、蛋白和基因水平檢測(cè)局麻藥致發(fā)育鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)其突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的影響,并探討和研究其可能涉及的機(jī)制。
   第一章羅:哌卡因致幼

10、鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥模型的建立
   目的:
   采用序貫法(up-downmethod)結(jié)合單位概率回歸法(probit法)測(cè)定SD幼鼠(P21日齡)清醒狀態(tài)下,0.5%羅哌卡因腹腔注射致其驚厥ED50及ED95。
   方法:
   選用健康SpragueDawley(SD)P21日齡幼鼠40只。用生理鹽水配置濃度為0.5%鹽酸羅哌卡因備用。羅哌卡因腹腔注射劑量分為5組,起始劑量為24mg/kg,相鄰

11、劑量間隔等比系數(shù)為0.8。其余劑量組依次為15.4mg/kg、19.2mg/kg、、30mg/kg、37.5mg/kg。
   序貫法操作:第一只實(shí)驗(yàn)鼠腹腔注射劑量為24mg/kg,如出現(xiàn)驚厥則下一只實(shí)驗(yàn)鼠腹腔注射劑量下調(diào)至較低相鄰劑量,即19.2mg/kg,如未出現(xiàn)驚厥則下一只實(shí)驗(yàn)鼠腹腔注射劑量上調(diào)至較高相鄰劑量,即30mg/kg,依次類推,直至所有動(dòng)物均接受一次注射。統(tǒng)計(jì)每個(gè)劑量組陽(yáng)性例數(shù)、陰性例數(shù)及總例數(shù)。記錄發(fā)生驚厥實(shí)驗(yàn)

12、鼠驚厥潛伏時(shí)間及持續(xù)時(shí)間。
   實(shí)驗(yàn)鼠行為依照Racine分級(jí)法進(jìn)行分級(jí),0級(jí):無(wú)任何反應(yīng),呈常態(tài)表現(xiàn);Ⅰ級(jí):點(diǎn)頭樣抖動(dòng)、面部肌肉痙攣表現(xiàn)如節(jié)律性眨眼、咀嚼、胡須抖動(dòng)等;Ⅱ級(jí):痙攣性表現(xiàn),點(diǎn)頭或甩尾;Ⅲ級(jí):一側(cè)前肢體陣攣性抖動(dòng);Ⅳ級(jí):雙側(cè)前肢體陣攣,但仍可站立;Ⅴ級(jí):全身陣攣性發(fā)作,失去平衡,無(wú)法站立,翻正不能。
   納入標(biāo)準(zhǔn):鼠發(fā)生驚厥以Racine分類Ⅴ級(jí)(翻正不能、直至全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作)為標(biāo)準(zhǔn)。驚厥結(jié)束以抽

13、搐停止,恢復(fù)自主行動(dòng)(翻正恢復(fù))為標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
   采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。用單位概率回歸法(probit法)測(cè)定羅哌卡因腹腔注射ED50及ED95。
   結(jié)果:
   發(fā)生驚厥實(shí)驗(yàn)鼠表現(xiàn)為自由活動(dòng)減少,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵陝?dòng)、無(wú)目的性奔跑、肢體攣縮倒地、翻正不能、直至全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。腹腔注射羅哌卡因后從注射到出現(xiàn)驚厥時(shí)間(潛伏期)為4.7±0.9m

14、in,自出現(xiàn)驚厥到驚厥結(jié)束(持續(xù)時(shí)間)為26.4±6.0min。經(jīng)probit法計(jì)算得出方程式為:y=-17.89+12.75(1g劑量),得出0.5%羅哌卡因P21日齡SD幼鼠腹腔注射致驚厥劑量ED50為25.12mg/kg(95%可信區(qū)間為22.38-27.54mg/kg)。ED95為33.79mg/kg(95%可信區(qū)間為29.99-48.38mg/kg)。
   結(jié)論:
   采用序貫法結(jié)合單位概率回歸法(prob

15、it法)測(cè)定清醒狀態(tài)下,SD大鼠(P21日齡)腹腔注射0.5%羅哌卡因致驚厥ED50及ED95值分別為25.12mg/kg和33.79mg/kg。
   第二章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)其學(xué)習(xí)記憶的影響
   目的:
   采用第一章測(cè)得的0.5%羅哌卡因致P21日齡SD幼鼠驚厥ED95值,制備中樞神經(jīng)單次和反復(fù)毒性驚厥模型。用Morris水迷宮測(cè)定驚厥后實(shí)驗(yàn)鼠的近期和成年期學(xué)習(xí)記憶能力變化。
  

16、 方法:
   選用21日齡SD幼鼠,采用第一章實(shí)驗(yàn)測(cè)得的0.5%羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射,達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)者入選實(shí)驗(yàn),死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實(shí)驗(yàn),納入實(shí)驗(yàn)鼠30只。
   納入標(biāo)準(zhǔn):同第一章。
   實(shí)驗(yàn)分組:單次驚厥組(R,n=10):單次腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR,n=10):腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg,1次/d,連續(xù)5d;對(duì)

17、照組(C,n=10):腹腔注射注射等量的生理鹽水。各組分別注射后1h~第3d、第5d~第7d、第60日齡(P60)~第62日齡進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。
   測(cè)試內(nèi)容:①定位航行實(shí)驗(yàn):測(cè)試經(jīng)歷3天,每天上、下午各測(cè)試1次。實(shí)驗(yàn)鼠由不同落水點(diǎn)面朝桶壁入水,軟件自動(dòng)記錄大鼠自入水至找到平臺(tái)(在平臺(tái)停留時(shí)間為5s)的圖像,并分析其路徑、游泳速度和所用時(shí)間(逃避潛伏期)。如實(shí)驗(yàn)鼠在120s內(nèi)仍未尋找到平臺(tái),則由操作者引導(dǎo)至平臺(tái)并停留5s,記錄其

18、潛伏期為120s。②空間探索實(shí)驗(yàn):最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(訓(xùn)練第4d、8d、P62),撤除水池中的平臺(tái)。將實(shí)驗(yàn)鼠由3個(gè)落水點(diǎn)面壁放入水中,記錄大鼠在120s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)及在此象限內(nèi)的游泳時(shí)間。③觀察尋找平臺(tái)潛伏期探索策略。
   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
   采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。大鼠尋找平臺(tái)逃避潛伏期采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì);同一時(shí)點(diǎn)不同組間,組

19、內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間均采用One-WayANOVA方差分析。穿越平臺(tái)次數(shù)、在平臺(tái)所在象限游泳時(shí)均采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)果:
   定位航行實(shí)驗(yàn)尋找平臺(tái)潛伏期
   第1~3d定位航行實(shí)驗(yàn)尋找平臺(tái)潛伏期:經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析,3組間不同時(shí)間點(diǎn)尋找平臺(tái)潛伏期有顯著差異(F=288.96,P<0.001);對(duì)照組、單次組及反復(fù)組均隨訓(xùn)練時(shí)間的增加,潛

20、伏期逐漸縮短(F=225.094,P<0.001;F=152.614,P<0.001;F=46.603,P<0.001);第1天、第2天和第3天3組間訓(xùn)練潛伏期均有顯著差異(F=7.371,P<0.005;F=111.73,P<0.001;F=172.096,P<0.001)。進(jìn)一步用LSD兩兩比較分析各組之間的差異:第1、2天潛伏期時(shí)間,對(duì)照組分別與單次組、反復(fù)組比較組間均有顯著差異(P<0.05),單次組和反復(fù)組潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)

21、照組;而單次組和反復(fù)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);第3天潛伏期時(shí)間分析,對(duì)照組與單次組間潛伏期時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),對(duì)照組、單次組分別與反復(fù)組比較,均有顯著性差異(P<0.05),反復(fù)組潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組和單次組。
   第5~7d定位航行實(shí)驗(yàn)尋找平臺(tái)潛伏期:經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析,3組間不同時(shí)點(diǎn)尋找平臺(tái)潛伏期有顯著差異(F=19.361,P<0.001);對(duì)照組和單次驚厥組均隨訓(xùn)練時(shí)間增加潛伏期逐漸縮短(F=

22、14.75,P<0.001;F=17.194,P<0.001);反復(fù)驚厥組隨訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)尋找平臺(tái)潛伏期無(wú)明顯變化(F=2.777,P>0.05);第5、6、7天,3組間尋找平臺(tái)潛伏期有顯著差異(F=169.044,P<0.001;F=235.824,P<0.001;F=285.290,P<0.001),進(jìn)一步用LSD兩兩比較分析各組間的差異:第5、6、7天尋找平臺(tái)潛伏期,對(duì)照組、單次驚厥組與反復(fù)驚厥組比較,組間均有顯著差異(P<0.05

23、),反復(fù)組潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組;而對(duì)照組和單次驚厥組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
   P60~P62天定位航行實(shí)驗(yàn)尋找平臺(tái)潛伏期:經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析,3組間不同時(shí)點(diǎn)尋找平臺(tái)潛伏期有顯著差異(F=80.667,P<0.001);3組尋找平臺(tái)潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(F=16.718,P<0.001;F=20.580,P<0.001;F=14.214,P<0.001);尋找平臺(tái)潛伏期相同時(shí)點(diǎn)組間存在顯著差異(F=17

24、7.218,P<0.005;F=353.348,P<0.001;F=269.125,P<0.001),進(jìn)一步用LSD兩兩比較分析各組之間的差異:在P60~P62天,反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組比較均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組;而對(duì)照組和單次驚厥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
   空間探索實(shí)驗(yàn)
   第4天空間探索實(shí)驗(yàn):①穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù):3組在第4天穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)有

25、顯著差異(F=43.246,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。②在原平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間:3組在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間有顯著差異(F=129.646,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組游泳時(shí)間明顯少

26、于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。
   第8天空間探索實(shí)驗(yàn):①穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù):第8天3組穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)有顯著差異(F=57.474,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。②在原平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間:3組在前3天測(cè)試結(jié)束后,在原

27、平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間有顯著差異(F=124.692,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組游泳時(shí)間明顯少于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。
   P62空間探索實(shí)驗(yàn):①穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù):3組在P62時(shí)間點(diǎn)穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)有顯著差異(F=25.327,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照

28、組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。②在原平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間:3組在前3天測(cè)試結(jié)束后,在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間有顯著差異(F=120.061,P<0.001);進(jìn)一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn),反復(fù)驚厥組與對(duì)照組、單次驚厥組均有顯著差異(P<0.05),反復(fù)驚厥組游泳時(shí)間明顯少于對(duì)照組和單次組;而單次驚厥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。平

29、臺(tái)潛伏期探索策略
   3組大鼠尋找平臺(tái)潛伏期探索策略:對(duì)照組大鼠多采用直線和趨向式策略;單次組大鼠1~3d多采用邊緣式和趨向式,5~d和P60~62多以直線式和趨向式為主;反復(fù)組多以邊緣式和隨機(jī)式為主。
   結(jié)論:
   1.羅哌卡因致SD幼鼠(P21日齡)單次中樞神經(jīng)毒性驚厥后學(xué)習(xí)記憶能力有一過(guò)性減弱,至驚厥后3天即恢復(fù)至正常水平,對(duì)其成年后學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯損害。
   2.羅哌卡因致SD幼鼠(P

30、21日齡)中樞神經(jīng)反復(fù)毒性驚厥對(duì)其近期及成年后學(xué)習(xí)記憶能力均有影響,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力減弱。
   第三章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)海馬突觸發(fā)育超微結(jié)構(gòu)的影響
   目的:
   本章節(jié)通過(guò)制備驚厥模型,觀察發(fā)生驚厥SD幼鼠海馬突觸發(fā)育結(jié)構(gòu)變化,以明確羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)其突觸發(fā)育是否會(huì)造成影響,以及與學(xué)習(xí)記憶能力的改變有何聯(lián)系。
   方法:
   選用21日齡SD幼鼠,采用

31、第一章實(shí)驗(yàn)得出0.5%羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射,達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)者入選實(shí)驗(yàn),死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實(shí)驗(yàn),共有實(shí)驗(yàn)鼠36只納入實(shí)驗(yàn)。
   納入標(biāo)準(zhǔn):同第一章。
   實(shí)驗(yàn)分組:單次驚厥組(R,n=12):單次腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR,n=12):腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg,1次/d,連續(xù)5d;對(duì)照組(C,n=12):腹腔注射注入等量生理鹽水

32、。每組根據(jù)處死時(shí)間點(diǎn)不同(24h、3d、7d、P60)分為4個(gè)亞組(n=3)。
   各亞組取大鼠3只,多聚甲醛和戊二醛混合液灌注。灌注結(jié)束后快速于冰上剝出腦組織,取出雙側(cè)海馬組織。按照大鼠腦定位圖譜,在解剖顯微鏡下切取大小約1mm3的海馬CA1區(qū)組織塊,放入2.5%的戊二醛電鏡液中固定。每只實(shí)驗(yàn)鼠選取2張銅網(wǎng)進(jìn)行觀察測(cè)量,觀察內(nèi)容包括神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。在每張銅網(wǎng)上隨機(jī)選取10個(gè)結(jié)構(gòu)清楚的突觸,運(yùn)用電鏡標(biāo)尺對(duì)突觸前后膜間隙和突

33、觸后致密物厚度進(jìn)行測(cè)量。在透射電鏡放大46000倍數(shù)下對(duì)突觸數(shù)目進(jìn)行測(cè)量分析。
   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
   采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。突觸后致密物厚度、突觸間隙寬度、突觸數(shù)目均采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)果:
   海馬CA1區(qū)神經(jīng)氈一般形態(tài)變化
   對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元形

34、態(tài)規(guī)則完整,結(jié)構(gòu)清楚。細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞核呈圓形,染色質(zhì)顆粒分布均勻;胞內(nèi)線粒體豐富,呈圓形或橢圓形,線粒體內(nèi)嵴清晰,規(guī)則排列;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基小體發(fā)達(dá)。神經(jīng)氈樹(shù)突中線粒體數(shù)目較多,軸突內(nèi)可見(jiàn)神經(jīng)微管。反復(fù)驚厥組在24h、3d、7d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少;神經(jīng)元胞漿固縮、濃染,星形膠質(zhì)細(xì)胞高度水腫、液化、核固縮。視野內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞核腫脹,形態(tài)不規(guī)則,核膜腫脹,結(jié)構(gòu)不清晰細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)顆粒分布不均;線粒體出現(xiàn)腫脹,可見(jiàn)空泡、固縮現(xiàn)象。

35、在P60時(shí)間點(diǎn)電鏡下海馬神經(jīng)元、線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)基本恢復(fù)正常。單次驚厥組電鏡下觀察,僅在驚厥后24h、3d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元出現(xiàn)水腫,核膜尚完整,細(xì)胞核形態(tài)基本正常,少量線粒體出現(xiàn)水腫,偶見(jiàn)線粒體嵴斷裂和空泡現(xiàn)象;在7d、P60時(shí)間點(diǎn)基本恢復(fù)正常。
   突觸超微結(jié)構(gòu)變化
   對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)突觸數(shù)目豐富,散在。突觸結(jié)構(gòu)清晰,突觸前膜、突觸間隙及突觸后膜致密物清晰可見(jiàn)。在突觸前膜靠近突觸間隙一側(cè)可見(jiàn)較多形態(tài)規(guī)則、大小均勻的突觸小

36、泡。突觸間隙清晰可見(jiàn),突觸后致密結(jié)構(gòu)較厚,散在均勻致密顆粒。反復(fù)驚厥組,除P60時(shí)間點(diǎn)外,其余各時(shí)間點(diǎn)突觸數(shù)目均較對(duì)照組顯著減少,尤其在3d、7d時(shí)間點(diǎn)。突觸結(jié)構(gòu)模糊不清,突觸間隙明顯增寬,突觸小泡散在,形態(tài)大小不均,突觸后致密物變薄。單次驚厥組在24h、3d時(shí)間點(diǎn),突觸數(shù)目稍減少,突觸結(jié)構(gòu)尚清晰,間隙稍增寬,突觸后致密物厚度無(wú)明顯變化。在7d和P60時(shí)間點(diǎn),突觸結(jié)構(gòu)基本正常。海馬CA1區(qū)突觸數(shù)、突觸間隙和突觸后致密物厚度比較
 

37、  單次驚厥早期(24h、3d),突觸數(shù)目較對(duì)照組減少,突觸間隙較對(duì)照組增寬(P<0.05),在驚厥后7d及實(shí)驗(yàn)鼠成年期(P60)和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);單次驚厥組突觸后致密物在驚厥后24h時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較明顯變薄,其余時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);反復(fù)驚厥組在驚厥后24h、3d、7d時(shí)間點(diǎn),突觸數(shù)目較對(duì)照組和單次驚厥組均明顯減少,突觸間隙明顯增寬,突觸后致密物明顯變?。≒<0.05),成年期(P

38、60)與對(duì)照組及單次組比較三者均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
   結(jié)論:
   羅哌卡因致SD幼鼠(P21日齡)中樞神經(jīng)毒性驚厥影響海馬CA1區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為線粒體破壞,突觸數(shù)目減少,突觸間隙增寬,突觸后致密物變薄。單次及反復(fù)驚厥對(duì)其成年后海馬突觸發(fā)育無(wú)明顯影響。
   第四章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)海馬突觸素表達(dá)的影響
   目的:
   本章節(jié)內(nèi)容采用免疫組化及Wester

39、nBlot方法檢測(cè)驚厥大鼠海馬不同時(shí)點(diǎn)突觸素表達(dá),觀測(cè)局麻藥致大鼠驚厥是否影響其表達(dá),以及與突觸發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶的聯(lián)系。
   方法:
   選用21日齡SD幼鼠,采用第一章實(shí)驗(yàn)得出的0.5%羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射,達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)者入選實(shí)驗(yàn),死亡或未發(fā)生驚厥者予以剔除,共選用實(shí)驗(yàn)鼠108只。
   納入標(biāo)準(zhǔn):同第一章。
   實(shí)驗(yàn)分組:單次驚厥組(R,n=36):單次腹腔注

40、射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR,n=36):腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg,1次/d,連續(xù)5d;對(duì)照組(C,n=36):腹腔注射注射等量生理鹽水。每組根據(jù)處死時(shí)間點(diǎn)不同(24h、3d、7d、P60)分為4個(gè)亞組(n=9)。
   各亞組取6只大鼠制備免疫組織化標(biāo)本,灌注后迅速取腦切成薄片置入多聚甲醛固定。進(jìn)入腦片包埋、切片、染色過(guò)程。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍片,每只動(dòng)物取6張切片,用IPP圖

41、像處理軟件,測(cè)量海馬CA1區(qū)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值。另外每組各時(shí)間點(diǎn)再各取3只,給予3%水合氯醛腹腔注射麻醉。迅速斷頭于冰上取腦,分離出雙側(cè)海馬組織,用WesternBlot免疫印跡法測(cè)定大鼠海馬突觸素蛋白含量。掃描X膠片,采用Quantityone圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的吸光度值,以β-actin條帶吸光度值為參照,兩者比值為突觸素蛋白的表達(dá)水平。
   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
   采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)

42、量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。不同時(shí)間點(diǎn)間各組突觸素表達(dá)采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)果:
   海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)
   單次驚厥組與對(duì)照組相比,海馬CA1區(qū)突觸素蛋白水平表達(dá)僅在驚厥后24h時(shí)間點(diǎn)低于對(duì)照組(P<0.05),其余各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異;反復(fù)驚厥組與對(duì)照組比較,海馬CA1區(qū)突觸素蛋白表達(dá)除P60時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其

43、余各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05);反復(fù)驚厥組與單次驚厥組比較,鼠海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)水平除P60時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其余時(shí)間點(diǎn)均顯著低于單次驚厥組(P<0.05)。
   WesternBlot檢測(cè)大鼠海馬突觸素表達(dá)
   單次驚厥組與對(duì)照組相比,海馬突觸素蛋白水平表達(dá)僅在驚厥后24h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其余各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異;反復(fù)驚厥組與對(duì)照組比較,海馬突觸素蛋白表達(dá)除P60時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)

44、計(jì)學(xué)差異外,其余各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05);反復(fù)驚厥組與單次驚厥組比較,鼠海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)水平除P60時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其余時(shí)間點(diǎn)均顯著低于單次驚厥組(P<0.05)。
   結(jié)論:
   1.羅哌卡因致SD幼鼠(P21日齡)單次驚厥對(duì)海馬突觸素表達(dá)有一過(guò)性影響,在驚厥后第3天基本恢復(fù)至正常,對(duì)成年期海馬突觸素表達(dá)無(wú)影響。
   2.SD幼鼠(P21日齡)經(jīng)歷反復(fù)驚厥后,海馬突觸素表達(dá)減少

45、至驚厥后第7天,對(duì)其成年后表達(dá)無(wú)影響。
   第五章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)海馬CaMKⅡ和p-CREB和表達(dá)的影響
   目的:
   本章通過(guò)制備羅哌卡因驚厥模型,運(yùn)用WesternBlot和QT-PCR技術(shù)對(duì)海馬CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),觀察CaMKⅡ和p-CREB在局麻藥毒性驚厥對(duì)突觸發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶的影響。
   方法:
   選選用21日齡SD幼鼠,采

46、用第一章實(shí)驗(yàn)得出的0.5%羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射,達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)者入選實(shí)驗(yàn),死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實(shí)驗(yàn),共選用實(shí)驗(yàn)鼠120只。
   納入標(biāo)準(zhǔn):同第一章。
   實(shí)驗(yàn)分組:單次驚厥組(R,n=40):單次腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR,n=40):腹腔注射0.5%羅哌卡因33.8mg/kg,1次/d,連續(xù)5d:對(duì)照組(C,n=40):腹腔注射注射等量生理鹽水

47、。每組根據(jù)處死時(shí)點(diǎn)不同(24h、3d、7d、P60)分為4個(gè)亞組(n=10)。
   合成CaMKⅡ和CREB上下游引物。每亞組取5只大鼠提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:93℃3min,然后93℃45s,55℃1min,共循環(huán)40次,對(duì)整個(gè)升溫過(guò)程進(jìn)行全程熒光信號(hào)收集,繪制融解曲線并分析。定量的方法以2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閾值)來(lái)表達(dá)基因的表達(dá)量,計(jì)算公式為△△Ct=[Ct(待測(cè)組目標(biāo)基因)—Ct(內(nèi)參)]—[

48、Ct(對(duì)照組目標(biāo)基因)—Ct(內(nèi)參)]。
   另外每組各時(shí)間點(diǎn)再各取5只,給予3%水合氯醛腹腔注射麻醉。迅速斷頭于冰上取腦,分離出雙側(cè)海馬組織,用WesternBlot免疫印跡法測(cè)定大鼠海馬CaMKⅡ和p-CREB含量。掃描X膠片,采用Quantityone圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的吸光度值,以β-actin條帶吸光度值為參照,兩者比值為蛋白的表達(dá)水平。
   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
   采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)

49、統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。各時(shí)間點(diǎn)不同組間CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達(dá)水平比較采用One-WayANOVA;兩兩比較采用LSD法,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)果:
   CaMKⅡ在各組的表達(dá)情況
   24h和3d時(shí)間點(diǎn)單次驚厥組CaMKⅡ基因表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異。24h、3d、7d及P60時(shí)點(diǎn)反復(fù)驚厥組CaMKⅡ的表達(dá)均明顯低于對(duì)

50、照組(P<0.05);24h、3d、7d及P60時(shí)點(diǎn)反復(fù)驚厥組CaMKⅡ的表達(dá)均明顯低于單次驚厥組(P<0.05)。
   CREB在各組的表達(dá)情況
   單次驚厥組p-CREB在24h、3d、7d及P60時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異(P>0.05);反復(fù)驚厥組CREB在24h、3d、7d及P60時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組和單次驚厥組(P<0.05)
   結(jié)論:
   1.羅哌卡因致SD幼鼠(P

51、21日齡)毒性單次驚厥后海馬CaMKⅡ在驚厥后24h、3d表達(dá)明顯降低。羅哌卡因致幼鼠反復(fù)驚厥在驚厥早期及成年后CaMKⅡ表達(dá)均明顯減少。
   2.羅哌卡因致SD幼鼠(P21日齡)單次毒性驚厥對(duì)海馬p-CREB的表達(dá)無(wú)影響,羅哌卡因致幼鼠反復(fù)毒性驚厥海馬p-CREB的表達(dá)在驚厥早期和成年均明顯減少。
   全文結(jié)論:
   1.羅哌卡因致幼鼠(P21日齡)中樞神經(jīng)毒性驚厥影響其突觸可塑性:單次及反復(fù)驚厥大鼠均表

52、現(xiàn)為海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目減少、突觸間隙增寬、突觸后致密物變薄,反復(fù)驚厥比單次驚厥所致?lián)p害程度更為嚴(yán)重,且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。
   2.羅哌卡因致幼鼠(P21日齡)中樞神經(jīng)毒性驚厥影響其學(xué)習(xí)記憶能力:單次驚厥大鼠表現(xiàn)為—過(guò)性的學(xué)習(xí)能力障礙,而反復(fù)驚厥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙持續(xù)至成年后。
   3.羅哌卡因致幼鼠(P21日齡)中樞神經(jīng)毒性驚厥對(duì)其學(xué)習(xí)記憶的影響可能與突觸可塑性破壞、海馬突觸素表達(dá)下調(diào)、CamkⅡ及p-CREB表達(dá)下

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