CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)抗B細(xì)胞淋巴瘤作用研究.pdf

1、目的:
　　 惡性淋巴瘤(Malignant Lymphoma，ML)是起源于淋巴結(jié)及淋巴組織的一組高度異質(zhì)性、具有侵襲性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上升趨勢。近年來，隨著新藥尤其是靶向藥物的不斷問世，惡性淋巴瘤的治療水平有了長足的進(jìn)步，部分病種的完全緩解(complete remission; CR)率已達(dá)50％-70％，甚至更高，但最終僅有部分患者可獲得長期無病生存，而相當(dāng)比例的患者疾病復(fù)發(fā)，其主要原因?yàn)槲⑿埩舨≡畹?/p>

2、存在。過繼細(xì)胞免疫治療(adoptive cellularimmunotherapy，ACI)是向腫瘤患者輸注自體或異體具有抗腫瘤活性，能直接或間接發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的免疫細(xì)胞，對體內(nèi)殘存腫瘤細(xì)胞具有更直接更有效的殺滅作用，從而達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的作用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell，CIK)是體外經(jīng)抗CD3單抗、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2(IL-2)等細(xì)胞因

3、子聯(lián)合作用產(chǎn)生的一類具有較強(qiáng)抗腫瘤活性和非MHC限制殺瘤特點(diǎn)的T淋巴細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前認(rèn)為功能最強(qiáng)的抗原體提呈細(xì)胞，能有效的將腫瘤抗原提呈給T淋巴細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞間起到橋梁作用。多項(xiàng)研究提示，CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺瘤作用，并在多種腫瘤領(lǐng)域獲得較好的效果，但其臨床應(yīng)用主要集中于自體DC-CIK細(xì)胞免疫治療，且CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)細(xì)胞對B-NHL體外殺傷作用研究很少。

4、>　　 本研究一方面觀察健康人群CIK細(xì)胞與DC混合培養(yǎng)過程中細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞因子分泌水平及對Raji細(xì)胞殺傷活性的變化，以單純CIK細(xì)胞抗腫瘤作用相比較，以求進(jìn)一步證實(shí)CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著提高;另一方面，比較健康人群與B-NHL患者DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)第15d時細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞因子分泌水平及對Raji細(xì)胞殺傷活性明確兩者之間的差異;在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討健康人群DC-CIK細(xì)胞對

5、不同B-NHL細(xì)胞的殺傷活性。為異體DC-CIK細(xì)胞免疫治療更好的應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。
　　 方法:
　　 1.抽取健康志愿者或B-NHL患者外周血50ml，常規(guī)單個核細(xì)胞提取法分離提取單個核細(xì)胞，于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h;收集貼壁細(xì)胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，非貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，分別培養(yǎng)9d;將成熟DC與CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)6d，以單純CIK細(xì)胞作為對照組。
　　 2.用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形

6、態(tài)變化;細(xì)胞計數(shù)儀采用臺盼藍(lán)染色法計數(shù)。
　　 3.采用流式細(xì)胞儀于培養(yǎng)第9d檢測DC細(xì)胞免疫表型;于第12d、15d檢測CIK細(xì)胞及DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞免疫表型。
　　 4.于培養(yǎng)第15d收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-12和TNF-α細(xì)胞因子分泌量。
　　 5.采用MTT比色法檢測效靶細(xì)胞比5∶1、10∶1、20∶1條件下，CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞對B-NHL細(xì)胞的殺傷活性

7、。
　　 結(jié)果:
　　 1.CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著增強(qiáng)。共培養(yǎng)細(xì)胞組CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞比例、細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12分泌量均明顯高于單純CIK細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.健康人群和NHL患者相比，細(xì)胞培養(yǎng)第15d DC-CIK細(xì)胞數(shù)量、CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞比例、細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12分

8、泌量均明顯增加。2組細(xì)胞對Raji細(xì)胞均顯示出較強(qiáng)的殺傷活性，在同一效靶比條件下，健康人群組DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤作用明顯優(yōu)于NHL患者組。
　　 3.健康人群DC-CIK細(xì)胞對不同B-NHL細(xì)胞（SU-DHL4細(xì)胞、Raji細(xì)胞、KARPAS422細(xì)胞）均有較強(qiáng)細(xì)胞毒作用，且隨效靶比增加殺傷作用增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，其增殖活性和殺傷活性顯著提高。與NHL患者相比，細(xì)胞培養(yǎng)第15d