Ad-TRAIL對T淋巴瘤細(xì)胞株殺傷作用研究套細(xì)胞淋巴瘤臨床預(yù)后分析.pdf

1、第1章：攜帶TRAIL基因的重組腺病毒對T淋巴瘤細(xì)胞株的殺傷作用研究1.研究背景&目的非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)為目前增長速度最快的惡性腫瘤，與西方國家相比，T細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-hodgkin'slymphoma,T-NHL)在中國、日本等亞洲人群中發(fā)病率較高，與B細(xì)胞性淋巴瘤(B-cell non-hodgkin's lymphoma，B-NHL)相比，T-NHL

2、的侵襲性更強(qiáng)，尚缺乏統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)后不佳。有必要尋找新的治療藥物和手段。有相當(dāng)一部分的患者以結(jié)外局部發(fā)病為主，目前，對局部病灶的治療手段包括放療，電子線照射及氮芥外敷等，但這些治療方法的副作用較大，療效不佳。因此，亟需探尋新的局部治療手段。 在腫瘤的局部治療中，基因治療是一種全新的治療方法，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAI

3、L)作為外源性凋亡信號傳導(dǎo)的重要啟動因子，因能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡而對正常組織和細(xì)胞沒有毒性受到廣泛關(guān)注。臨床前研究提示其為一種非常有前途的抗癌藥物，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但TRAIL蛋白為系統(tǒng)給藥，作用于病灶局部的濃度較低，且其體內(nèi)半衰期過短，亦有多種腫瘤細(xì)胞株呈現(xiàn)出對TRAIL的耐藥，因此發(fā)現(xiàn)一個新的治療策略以克服TRAIL蛋白的藥代動力學(xué)的缺點(diǎn)并克服其耐藥有著很大的臨床應(yīng)用價值。 利用基因載體介導(dǎo)TRAIL基因在瘤體內(nèi)

4、得到持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)可以克服TRAIL蛋白的缺點(diǎn)，大大的改善治療效果。我們之前的和其他的研究結(jié)果也表明，通過用腺病毒為載體，能很好地將TRAIL基因轉(zhuǎn)染入多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)膜連接的TRAIL而導(dǎo)致其凋亡，并因其產(chǎn)生膜連接的TRAIL有旁觀者效應(yīng)(bystander effect)從而明顯增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤活性，而且可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL蛋白的耐藥。攜帶TRAIL基因的重組腺病毒(Ad-TRAIL，AdT)已被證實(shí)對惡性黑色素瘤、

5、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞株有殺傷作用，顯示出了強(qiáng)大的抗腫瘤活性，但尚未有作用于T淋巴瘤細(xì)胞株的報道。基于以上研究摹礎(chǔ)，為了改善T-NHL的治療效果，進(jìn)一步探索T-NHL的局部治療方法及擴(kuò)大AdT的治療范圍，我們考慮研究AdT對T-NHL的體外抗腫瘤作用。 2.研究方法 人T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株應(yīng)用攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重組腺病毒

6、載體(Ad-GFP，AdG)處理，以熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)情況；并以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的GFP表達(dá)率。以AdT處理Jurkat細(xì)胞后，RT-PCR檢測不同時間TRAIL基因的表達(dá)情況；MTT法檢測不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)下的細(xì)胞毒作用；臺盼藍(lán)染色計數(shù)法檢測AdT作用不同時間細(xì)胞的生長狀況；采用Propidium Iodide(PI)單染流式細(xì)胞儀檢測凋亡。分別以MTT法和Pro

7、pidium Iodide(PI)單染流式細(xì)胞儀檢測AdT和化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)、依托泊苷(etoposide，VP-16)、長春新堿(vincristine，VCR)、地塞米松(dexamethasone，DXM)聯(lián)合用藥的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞凋亡。 3.研究結(jié)果 3.1.腺病毒對Jurkat細(xì)胞的感染效率腺病毒可成功感染Jurkat細(xì)胞，病毒作用細(xì)胞48小時后于熒光顯微鏡下觀察，MOI為50時開

8、始看到GFP表達(dá)，表達(dá)量隨著感染病毒量的增加而逐漸增強(qiáng)；流式細(xì)胞儀檢測顯示，MOI為200時細(xì)胞GFP的表達(dá)率為(67.2±3.5)％；MOI為400時細(xì)胞GFP的表達(dá)率為(81.5±4.7)％。 3.2. AdT感染細(xì)胞后TRAIL基因的表達(dá)病毒感染后目的基因TRAIL可有效表達(dá)，并持續(xù)至感染后7天左右。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，AdT感染Jurkat細(xì)胞后，TRAIL基因的表達(dá)逐漸增高，第3大達(dá)到了高峰，隨后表達(dá)逐漸下降，第7天

9、只能檢測到TRAIL基因微弱的表達(dá)。而AdG感染的腫瘤細(xì)胞沒有出現(xiàn)TRAIL的目的條帶。 3.3.AdT抑制Jurkat細(xì)胞的增殖AdT作用細(xì)胞后，可抑制Jurkat細(xì)胞的增殖。MTT檢測顯示，AdT對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制呈劑量依賴關(guān)系，AdG感染細(xì)胞后，并沒有明顯抑制Jurkat細(xì)胞的增殖；臺盼藍(lán)染色直接計數(shù)法顯示AdT感染細(xì)胞后對細(xì)胞的抑制作用隨時間延長而增加。 3.4.AdT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡PI染色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)

10、現(xiàn)，AdT可誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡，且隨著劑量增加，誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)。AdG感染細(xì)胞72小時后，與細(xì)胞對照組相比，凋亡率未見明顯增加。 3.5.AdT和化療藥物的聯(lián)合作用MTT和PI染色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，AdT和DXM聯(lián)合對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡起協(xié)同作用，AdT和ADM、VP-16、VCR聯(lián)合對細(xì)胞的增殖抑制為單純相加作用。 4.結(jié)論 1.腺病毒載體可以成功轉(zhuǎn)染T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株，并能持續(xù)

11、有效地表達(dá)目的基因。 2. AdT感染Jurkat細(xì)胞后對細(xì)胞株有增殖抑制作用，并呈劑量和時間依賴性。 3. AdT主要通過誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡而抑制增殖。 4.AdT與DXM聯(lián)合對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡可能有協(xié)同作用。 5.AdT和ADM、VP-16、VCR聯(lián)用對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制為單純相加作用。 第2章：套細(xì)胞淋巴瘤臨床預(yù)后分析1.研究背景&目的套細(xì)胞淋巴瘤(mant

12、le cell lymphoma，MCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma，NHL)的一種少見亞型，診斷時多為晚期(AnnArbor分期Ⅲ～Ⅳ期)，采用目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法不可治愈。初治時雖然對治療反應(yīng)敏感，但緩解期短，復(fù)發(fā)率較高，復(fù)發(fā)后疾病更具侵襲性且對治療反應(yīng)變差，緩解期明顯縮短。MCL的中位牛存期僅3～4年，屬于NHL中預(yù)后最差的亞型之一。目前國內(nèi)尚無大宗病例的報道。本研究的目的在于探討中國人MCL的臨床

13、病理特征，診治方法和影響預(yù)后的因素。 2.研究方法回顧性分析2000年到2007年中山大學(xué)腫瘤防治中心和南方醫(yī)院收治的45例MCL患者。收集其臨床資料如年齡、分期、PS、國際預(yù)后指數(shù)評分等和治療效果、生存情況，采用Kaplan-meier法進(jìn)行生存分析，采用Log-rank檢驗(yàn)和COX部分風(fēng)險模型進(jìn)行預(yù)后因素分析。 3.研究結(jié)果 全組患者中位年齡56歲(23～76歲)；男女之比為3.5:1；33例患者(73.3％)以全身

14、淋巴結(jié)腫大為首發(fā)癥狀；初診時，27例(60.0％)有結(jié)外侵犯，37例(82.2％)為晚期病例(Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期)；26例(57.8％)患者國際預(yù)后指數(shù)大于1分。僅有16例(35.6％)患者在初次病理診斷時能夠明確分型，29例患者被誤診為其他亞型。43例患者接受聯(lián)合化療，總反應(yīng)率為76.7％，接受CHOP方案或類似方案化療的患者總反應(yīng)率和完全緩解率分別為73.3％和30.0％；接受R-CHOP或類似方案化療的患者總反應(yīng)率和完

15、全緩解率分別為81.8％和72.7％。中位隨訪時間38個月，全組患者的5年總生存率為17.3％，2年無病生存率為27.2％，3年無病生存率為0。中位無進(jìn)展生存期20個月。CHOP組和R-CHOP組的總生存率及無病生存率無顯著性差異。29例(64.4％)患者在隨訪過程中出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展。本研究中，單因素分析顯示，MCL的預(yù)后因素包括治療前PS、LDH、B癥狀、骨髓侵犯、外周血侵犯。多因素分析結(jié)果顯示，只有PS和骨髓侵犯為影響MCL總生存