一種新型基因載體—納米級(jí)超聲微泡的制備及其介導(dǎo)PNP-Fludarabine自殺基因系統(tǒng)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文一種新型基因載體—納米級(jí)超聲微泡的制備及其介導(dǎo)PNPFludarabine自殺基因系統(tǒng)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：何剪太20100501中南大學(xué)博士學(xué)位論文因治療手段提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[方法]1、選擇DPPC、DPPA混合磷脂以及全氟丙烷氣體等材料采用高剪切分散法進(jìn)行納米級(jí)超聲微泡的研制，并通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法選擇最優(yōu)制備方法。2、采用MTT法檢測(cè)不同濃度的納米級(jí)超聲微泡對(duì)HepG2肝癌

2、細(xì)胞的細(xì)胞毒性，選擇安全濃度范圍；以GFP為目的基因，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀以及實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)納米級(jí)超聲微泡與DNA質(zhì)粒的結(jié)合效率和體外基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率，并與相同條件下脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率進(jìn)行比較，以及超聲照射后納米級(jí)超聲微泡對(duì)目的基因轉(zhuǎn)染效率的改變。3、選用真核基因表達(dá)系統(tǒng)pcDNA31()和PNP自行構(gòu)建自殺基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA31()IPNP，基因克隆鑒定采用限制酶SalI和EcoRV雙酶切鑒定、PCR鑒定以及重組質(zhì)粒核酸序列

3、測(cè)定。4、以超聲照射介導(dǎo)自制的納米級(jí)超聲微泡作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以自行構(gòu)建的自殺基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA31()／PNP作為治療基因，并以Fludarabine前藥處理進(jìn)行肝癌的基因治療研究。先用RT—PCR方法檢測(cè)兩株細(xì)胞系中PNP的表達(dá)情況；再以AFP高表達(dá)的HepG2細(xì)胞與AFP低表達(dá)的SMMC7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，將重組質(zhì)粒pcDNA31()／PNP轉(zhuǎn)染入各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)PNP／Fludarabine系統(tǒng)對(duì)兩種肝癌細(xì)