HA納米載體介導(dǎo)hGM-CSF基因轉(zhuǎn)染制備肝癌疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移主要是因機(jī)體的抗腫瘤免疫功能低下而產(chǎn)生的,表現(xiàn)為免疫逃逸和免疫耐受;腫瘤疫苗通過增強(qiáng)腫瘤的抗原性而重建機(jī)體的免疫功能,已成為腫瘤防治的一種新療法,而將hGM-CSF基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞可使細(xì)胞的免疫原性大大增加。本研究通過具有良好的生物相溶性的HA納米顆粒攜帶hGM-CSF基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染,制備成轉(zhuǎn)hGM-CSF基因的肝癌疫苗,并且觀察HA納米載體用于基因轉(zhuǎn)染的安全性及hGM-CSF基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長(zhǎng)的影響,為基因修飾的自

2、體肝癌疫苗的臨床研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采集新鮮的肝癌組織,將其剪切、消化、離心制備成單細(xì)胞懸液,臺(tái)盤蘭染色分析細(xì)胞活力后進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代,通過檢測(cè)培養(yǎng)液中的AFP及ALB分泌水平以進(jìn)行肝癌細(xì)胞鑒定。采用MTT方法檢測(cè)HA納米載體對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響。用HA納米載體轉(zhuǎn)染技術(shù),將攜帶有人GM-CSF基因的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中,篩選G418抗性細(xì)胞,限制性稀釋法挑選G418抗性單克隆;采用RT-PCR方法鑒定hGM-CSF

3、基因的整合和表達(dá),ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的hGM-CSF分泌量和持續(xù)的時(shí)間;流式細(xì)胞術(shù)分析hGM-CSF基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長(zhǎng)的影響;經(jīng)致亞死量的r-射線照射制備成肝癌細(xì)胞疫苗。
　　結(jié)果:臺(tái)盤蘭染色分析分離的肝癌細(xì)胞細(xì)胞活力在80％以上,且在細(xì)胞培養(yǎng)液上清中測(cè)得有大量的AFP及少量ALB存在,對(duì)照培養(yǎng)基中只檢測(cè)到微量AFP及未檢測(cè)到ALB;MTT結(jié)果分析表明HA納米混懸液濃度在80μg/ml以下對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與對(duì)照組比

4、較差異無顯著性。RT-PCR顯示hGM-CSF基因在肝癌細(xì)胞中已整合及穩(wěn)定表達(dá)。ELISA檢測(cè)出轉(zhuǎn)入hGM-CSF基因的肝癌細(xì)胞能穩(wěn)定分泌hGM-CSF,其分泌量為216.22±45.78ng/106cell/24h。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示hGM-CSF基因不促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期無明顯影響。
　　結(jié)論:成功的從肝癌組織中分離培養(yǎng)出肝癌細(xì)胞;運(yùn)用HA納米載體可以安全的將目的基因hGM-CSF導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中且獲得穩(wěn)定表達(dá),成