Sa-hTNFα-hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗對PC3異種移植瘤治療效果的研究.pdf

1、背景:
　　前列腺癌發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計2015年檢出率在所有腫瘤中排第二，死亡率排第一，成為危害男性健康的惡性腫瘤。腫瘤常規(guī)三大療法:手術(shù)、化療、放療。但常規(guī)療法特異性不足，常常對正常器官和組織有損傷，損害了患者的生存質(zhì)量。免疫治療可以誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對腫瘤的特異性反應(yīng)，甚至能清除殘余的腫瘤病灶，誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫記憶。
　　腫瘤細(xì)胞疫苗屬于免疫療法，完整的、滅活的腫瘤細(xì)胞包含腫瘤所有抗原，腫瘤特異性抗原刺激

2、機體免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生針對此種腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。在腫瘤免疫中，T淋巴細(xì)胞應(yīng)答具有至關(guān)重要的作用。但單獨的腫瘤細(xì)胞往往對機體的刺激不足，難以介導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)作用，在腫瘤細(xì)胞疫苗中往往會添加免疫佐劑，增強疫苗的免疫原性。GM-CSF和TNFα都是良好的免疫佐劑，能夠很好地刺激粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、尤其是樹突狀細(xì)胞的增殖、分化，增強機體免疫強度，而且二者有很好的免疫協(xié)同作用。
　　針對前列腺癌在發(fā)展和和治療中易

3、由雄激素依賴階段演變?yōu)樾奂に胤且蕾囆偷奶匦?，已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗的GVAX(R)前列腺癌疫苗利用LNCaP和PC-3兩個細(xì)胞系作為抗原，LNCaP分泌總前列腺特異性抗原(tPSA)，具有前列腺癌腫瘤細(xì)胞早期分化的特征，用于抗早期雄激素依賴性的前列腺癌;PC-3作為雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞，已被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。但該疫苗的制備需要兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的培養(yǎng)制備，工序復(fù)雜、成本高、耗時較長，若利用我們的細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)

4、，而且能僅用一種細(xì)胞作為疫苗制備的抗原可以同時治療激素依賴和非依賴的前列腺癌將會很大程度的改善這些問題。
　　我們前期工作中，驗證了SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗對雄激素依賴的LNCaP前列腺癌療效顯著。此次，用PC-3細(xì)胞在hu-PBL-NOD/SCID小鼠皮下成瘤建造雄激素非依賴型前列腺癌模型，檢驗SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗對雄激素非依賴前列腺癌的治療效果，本

5、實驗將SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗組作為參照實驗組進(jìn)行研究，研究顯示SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗與SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗對雄激素非依賴的PC-3前列腺癌治療效果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　綜上說明SA-hTNFa/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP疫苗既對雄激素依賴前列腺癌有治療效果，又對雄激素非依賴前列腺癌有治療效果?？傻迷?/p>

6、整個前列腺癌治療過程中可以用單一的LNCaP細(xì)胞系作為抗原制作腫瘤疫苗，與GVAX(R)前列腺癌疫苗需要制備兩種細(xì)胞系相比，大大簡化了腫瘤疫苗的制作流程，節(jié)約了時間和成本，并且疫苗批次間更加穩(wěn)定。
　　目的:
　　1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重組蛋白進(jìn)行活性鑒定，及錨定率流式檢測。疫苗表面錨定蛋白生物活性檢測
　　2.建立具有人免疫系統(tǒng)的人外周血淋巴細(xì)胞-重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠嵌合體(hu-PBL-NOD/

7、SCID)模型，鑒定小鼠是否發(fā)生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)。
　　3.建立小鼠皮下腫瘤PC-3前列腺癌模型，比較SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP細(xì)胞疫苗和SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3細(xì)胞疫苗在動物水平的抗腫瘤效果。
　　4.監(jiān)測小鼠的體重、精神狀態(tài)，對小鼠主要臟器進(jìn)行HE染色，鑒定疫苗是否對小鼠有毒副作用。
　　方法

8、:
　　1.蛋白活性檢測:SDS-PAGE凝膠電泳鑒別SA-hTNFα蛋白SA-hGM-CSF蛋白的純化復(fù)性狀況。TNFα蛋白對小鼠成纖維細(xì)胞系L929有毒副作用，入紅白血病細(xì)胞的生長增殖需依賴GM-CSF蛋白，我們通過梯度稀釋這兩種蛋白和錨定蛋白的疫苗檢測對特異性細(xì)胞系生長增殖的影響來鑒定蛋白活性。
　　2.疫苗制作:將LNCaP細(xì)胞和PC-3細(xì)胞用30％酒精室溫固定30min，1mg/ml生物素化試劑37℃孵育30min

9、進(jìn)行生物素化，將重組蛋白SA-hTNFα蛋白、SA-hGM-CSF蛋白室溫孵育1h制成前列腺癌治療性疫苗。利用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測兩種重組蛋白的錨定效率，確定是否達(dá)到要求。
　　3.造模及疫苗效果檢測:敲除NK細(xì)胞后的NOD/SCID小鼠腹腔注射4×107 PBMCs/只，建立嵌合體小鼠，4周后檢測小鼠血液中hCD+4T細(xì)胞和hCD+8 T細(xì)胞。肋脅部皮下注射5×105PC-3前列腺癌細(xì)胞造模，此為觀察期第0天。在第0、7、14天分

10、別注射SA-hTNFα/ hGM-CSF雙重錨定的LNCaP前列腺癌治療性疫苗、SA-hTNFα/ hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3前列腺癌治療性疫苗、PBS。觀察60天，每隔一天測腫瘤大小，比較這兩種前列腺癌治療性疫苗的抗腫瘤效果。60天觀察期內(nèi)，記錄每組小鼠的生存曲線。觀察期結(jié)束后，對小鼠腫瘤做免疫組化hCD+4 T細(xì)胞和hCD+8 T細(xì)胞染色，查看免疫浸潤情況。對小鼠腫瘤進(jìn)行Ki67染色，比較每組小鼠腫瘤增殖活性。
　　

11、4.腫瘤特異性細(xì)胞毒性檢測:在皮下注射PC-3細(xì)胞造模后的第21天，每組取一只小鼠，取出脾臟，分離脾細(xì)胞，先讓脾細(xì)胞與絲裂霉素處理的PC-3作用致敏，之后，絲裂霉素處理過的PC-3鋪板，加入不同細(xì)胞倍數(shù)的脾細(xì)胞作用4個小時，CCK8檢測細(xì)胞活力，計算小鼠脾細(xì)胞的腫瘤特異性細(xì)胞毒性。
　　5.檢測疫苗等是否對小鼠有副作用:觀察期期間，檢測小鼠血清中ALT、AST含量，監(jiān)測小鼠是否發(fā)生GVHD。觀察期結(jié)束后，對小鼠的重要臟器做HE染色

12、進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重組蛋白具有很強的生物活性;錨定疫苗后蛋白依舊具有生物活性;經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，錨定率達(dá)到要求。
　　2.小鼠腹腔注射hPBMC4周后血液中依舊檢測到了hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞，小鼠脾、淋巴結(jié)hCD4+和hCD8+免疫組化顯示，小鼠脾、淋巴結(jié)均有hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞浸潤，結(jié)果說明成功建立了嵌合體小鼠。檢測小鼠血清中ALT、

13、AST的含量，并沒有異常升高;小鼠精神狀態(tài)無異常;無皮疹等說明未發(fā)生移植物抗宿主病。小鼠主要臟器的HE染色觀察無異常，說明腫瘤疫苗并未造成明顯毒副作用。
　　3.SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的LNCaP前列腺癌治療性疫苗組和SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定修飾的PC-3前列腺癌治療性疫苗組小鼠都有4只存活(4/4)，而PBS組只有1只小鼠存活(1/4)。疫苗組與PBS組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。小鼠

14、腫瘤中，兩疫苗組hCD4+T細(xì)胞和hCD8+T細(xì)胞浸潤程度明顯高于PBS組;免疫組化Ki67染色結(jié)果表明，PBS組腫瘤增殖活性明顯高于兩疫苗組。
　　結(jié)論:
　　本實驗成功建立了hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型，并未發(fā)生移植物宿主病;實驗結(jié)果表明SA-hTNFα/hGM-CSF雙重錨定的LNCaP前列腺癌治療性疫苗也能顯著抑制PC-3腫瘤增長，增強T淋巴細(xì)胞浸潤，延長荷瘤小鼠生存期，并對小鼠無毒副作用。這說明，以LNC