啟動(dòng)子對(duì)hGM-CSF基因在魚腥藻7120中表達(dá)影響的研究.pdf

1、藍(lán)藻是一種可以進(jìn)行放氧光合作用的原核生物。它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低、絕大多數(shù)不含毒素、營(yíng)養(yǎng)豐富、分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、便于外源基因轉(zhuǎn)化、蛋白酶活性低等優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)使藍(lán)藻有可能成為較大腸桿菌和酵母更為理想的基因工程宿主。隨著藍(lán)藻基因工程的發(fā)展，已有一批有應(yīng)用前景的外源基因得到成功表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻可以在醫(yī)藥和環(huán)保問題上得到應(yīng)用。而人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一個(gè)被克隆和利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的造血刺激因子，

2、是一個(gè)具有多項(xiàng)潛能的造血生長(zhǎng)因子，具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，在國(guó)際生物技術(shù)制藥市場(chǎng)上占有重要的位置。但是天然hGM-CSF因制備量少，純度不夠高等原因，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要。因此，用基因工程來生產(chǎn)hGM-CSF有其重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)意義以及獨(dú)特的優(yōu)越性。 外源基因在藍(lán)藻細(xì)胞中表達(dá)效率較低一直以來都是制約藍(lán)藻基因工程長(zhǎng)足發(fā)展的一個(gè)瓶頸。而影響藍(lán)藻外源基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵就是轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的調(diào)控，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄效率起決定作用的是由RNA聚

3、合酶與啟動(dòng)子之間相互作用所控制的起始過程，所以啟動(dòng)子的選擇對(duì)外源基因的表達(dá)至關(guān)重要。因此，本研究根據(jù)魚腥藻7120中RNA聚合酶的特性以及藍(lán)藻內(nèi)源啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選用了兩個(gè)藍(lán)藻內(nèi)源啟動(dòng)子Pcpcβ和PgroESL來起始轉(zhuǎn)錄表達(dá)外源基因hGM-CSF。運(yùn)用PCR方法，從藍(lán)藻中成功調(diào)出藻藍(lán)蛋白β亞基基因啟動(dòng)子Pcpcβ和熱休克基因啟動(dòng)子PgroESL，將外源基因插入到啟動(dòng)子的下游后進(jìn)一步與穿梭表達(dá)載體pDC-08相連構(gòu)建成兩個(gè)穿梭表達(dá)載體

4、pDC-C-GM和pDC-G-GM。利用三親接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化到魚腥藻7120中，通過相應(yīng)抗生素篩選并經(jīng)繼代培養(yǎng)后得到能穩(wěn)定遺傳的含有目的基因和目的啟動(dòng)子的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因藻cGM和gGM，并對(duì)轉(zhuǎn)基因藻的最適生長(zhǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選。測(cè)定了轉(zhuǎn)基因藻的生理活性、PCR及Western blotting的數(shù)據(jù)分析，以此來探測(cè)外源基因hGM-CSF在魚腥藻7120中的表達(dá)效率。 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下： 1．從聚球藻7002總DNA中

5、克隆出了Pcpcβ啟動(dòng)子，然后從實(shí)驗(yàn)室中已構(gòu)建好的pDC-GM載體中將被修飾的外源基因hGM-CSF經(jīng)雙酶切切下，將其插入到載體pUC-cpcβ的啟動(dòng)子Pcpcβ下游，最后將其連同啟動(dòng)子一起克隆到穿梭載體的pDC-08的相應(yīng)位點(diǎn)，成功的構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體pDC-C-GM，并通過三親接合轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)入魚腥藻7120中，通過抗生素篩選及繼代培養(yǎng)后，獲得了轉(zhuǎn)基因藻cGM。 2．從聚球藻7942總DNA中克隆出了熱休克啟動(dòng)子PgroESL

6、，然后從實(shí)驗(yàn)室中已構(gòu)建好的pDC-GM載體中將經(jīng)修飾的外源基因hGM-CSF經(jīng)雙酶切切下，將其插入到載體pUC-groESL的啟動(dòng)子PgroESL下游，最后將其連同啟動(dòng)子一起克隆到穿梭載體的pDC-08的相應(yīng)位點(diǎn)，成功的構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體pDC-G-GM，并通過三親接合轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)入魚腥藻7120中，通過抗生素篩選及繼代培養(yǎng)后，獲得了轉(zhuǎn)基因藻gGM。 3．對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因藻進(jìn)行了DNA水平檢測(cè)，通過PCR方法，測(cè)定了轉(zhuǎn)基因藻cGM基因

7、組DNA中已穩(wěn)定存在啟動(dòng)子Pcpcβ和外源基因hGM-CSF：轉(zhuǎn)基因藻gGM基因組DNA中已穩(wěn)定存在啟動(dòng)子PgroESL和外源基因hGM-CSF。 4．對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因藻進(jìn)行了優(yōu)化培養(yǎng)，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的范圍內(nèi)，兩種轉(zhuǎn)基因藻cGM和gGM的適宜溫度為30℃，適宜pH值為9.5，適宜光照強(qiáng)度為60-90μmol m<'-2>·s<'-1>5．對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因藻進(jìn)行了Western blotting檢測(cè)，表明在兩種轉(zhuǎn)基因藻中均表達(dá)了具有免疫活性

8、的hGM-CSF。利用軟件分析結(jié)果，證實(shí)Pcpβ啟動(dòng)下的hGM-CSF比啟動(dòng)子PpsbA下的hGM-CSF表達(dá)量提高90％；證實(shí)PgroESL啟動(dòng)下的hGM-CSF經(jīng)過高溫?zé)嵴T導(dǎo)后比PpsbA下的hGM-CSF表達(dá)量提高459％． 以上結(jié)果證明，替換了啟動(dòng)子的目的基因hGM-CSF在魚腥藻7120中的表達(dá)效率在一定程度上有了明顯提高，尤其是熱休克啟動(dòng)子PgroESL啟動(dòng)下的hGM-CSF經(jīng)過熱誘導(dǎo)后，表達(dá)量較PpsbA下的hGM