hGM-CSF在魚腥藻7120中的表達(dá)及其表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn).pdf

1、人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第一個被克隆和利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的造血刺激因子，是一個具有多項潛能的造血生長因子，具有十分重要的臨床應(yīng)用價值，在國際生物技術(shù)制藥市場上占有重要的位置。目前市場上銷售的hGM-CSF多是由大腸桿菌作為宿主生產(chǎn)的，由于其過表達(dá)及含內(nèi)毒素的缺點(diǎn)，人們曾嘗試在酵母、哺乳細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞中表達(dá)hGM-CSF，但或多或少都有一些缺陷。而藍(lán)藻作為新興的制備基因工程藥物的宿主具有遺傳背景簡單

2、，便于外源基因轉(zhuǎn)化、蛋白酶活性低、培養(yǎng)基低廉、不含內(nèi)毒素等優(yōu)點(diǎn)，是制備基因工程藥物的很有潛力的宿主。 本文在利用魚腥藻7120作為宿主成功表達(dá)hGM-CSF基因的基礎(chǔ)上，對克隆到的hGM-CSF進(jìn)行修飾，在基因的5’端添加了可以在藍(lán)藻中高效表達(dá)的SD序列，并將SD序列與起始密碼子ATG之間的距離調(diào)整為相差6個堿基，然后將hGM-CSF基因插入到中間載體pRL-439強(qiáng)啟動子PpsbA的下游，得到中間表達(dá)載體pRL-GMs，進(jìn)一步

3、插入到穿梭載體pDC-08的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成穿梭表達(dá)載體pDC-GMs。利用三親接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化魚腥藻7120，通過相應(yīng)抗生素篩選并經(jīng)繼代培養(yǎng)后得到含有目的基因的轉(zhuǎn)基因藻GMs藻株。并對轉(zhuǎn)基因藻的最適生長條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選。同時本文還針對前期所構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體系統(tǒng)存在穩(wěn)定性欠佳，質(zhì)粒易丟失的特點(diǎn)，所以又克隆了魚腥藻7120中編碼谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因，將其作為整合平臺，插入到pRL-721中的hGM-CSF基因和強(qiáng)啟動子P

4、psbA的上游，構(gòu)建成了整合載體pRG-GM。為提高h(yuǎn)GM-CSF基因在魚腥藻7120中的表達(dá)效率和提高外源基因在魚腥藻7120中的穩(wěn)定性提供了資料。 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：1.克隆hGM-CSF基因，在5’端添加SD序列，并調(diào)整SD序列與ATG間距離，然后將其插入強(qiáng)啟動子PpsbA的下游，克隆到穿梭載體pDC-08的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成穿梭表達(dá)載體pDC-GMs，然后利用三親接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻7120，通過相應(yīng)抗生素篩選并經(jīng)

5、繼代培養(yǎng)后得到含有目的基因的轉(zhuǎn)基因藻GMs藻株；轉(zhuǎn)基因藻DNA水平檢測，表明hGM-CSF已經(jīng)轉(zhuǎn)入GMs藻株中；WesternBlot分析表明，在轉(zhuǎn)基因藻中表達(dá)了具有免疫活性的hGM-CSF。 2.通過對轉(zhuǎn)基因藻的最適生長條件測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因藻株的最適生長溫度為30℃，最適pH值為9.5～10.5，在調(diào)整了環(huán)境因子的基本培養(yǎng)基中，GMs藻株與野生藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量并無顯著差異，建議使用BG-Ⅱ(-N)培養(yǎng)基。 3.

6、光合放氧測定結(jié)果顯示，在添加10mmol/L的NaHCO3后，相對于野生藻，GMs藻株的凈光合速率提高了32.3﹪，而真實光合速率上調(diào)了30.2﹪，光補(bǔ)償點(diǎn)下降了7個光強(qiáng)單位，光飽和點(diǎn)上調(diào)了約51個光強(qiáng)單位。 4.在研究添加外源碳源對轉(zhuǎn)基因藻生長的影響后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因藻與野生藻相比具有更強(qiáng)的利用無機(jī)碳源(NaHCO3)和有機(jī)碳源(葡萄糖)的能力，最適添加NaHCO3濃度為15mmol/L，最適添加葡萄糖濃度為1.5﹪。與添加NaH

7、CO3相比，葡萄糖對藻細(xì)胞的促進(jìn)作用更加明顯。這有利于實現(xiàn)微藻的高密度培養(yǎng)，也有利于以后的產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。 5.克隆了魚腥藻7120中編碼谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因作為整合平臺，將其插入到pRL-721中的hGM-CSF基因和強(qiáng)啟動子PpsbA的上游，構(gòu)建成了整合載體pRG-GM。 以上結(jié)果說明，我們選取魚腥藻7120作為宿主系統(tǒng)，成功表達(dá)了具有免疫活性的外源hGM-CSF。并且外源基因的轉(zhuǎn)入沒有影響宿主的生