基于多位點Gateway技術的慢病毒載體構建及其在胚胎干細胞基因轉(zhuǎn)導中的應用.pdf

1、本實驗的主要研究思路是，首先是通過Gateway技術構建系列的慢病毒質(zhì)粒(包括廣泛表達啟動子和組織特異啟動子兩種類型)；然后選取代表三胚層組織特異啟動子的三種慢病毒轉(zhuǎn)導人和食蟹猴的胚胎干細胞，對轉(zhuǎn)導后的細胞進行誘導分化，對所得到的熒光細胞進行鑒定和分析；最后選取攜帶廣泛表達啟動子的兩種慢病毒載體進行小鼠iPS細胞轉(zhuǎn)導的初步研究；因此，本研究主要分為以下四個部分：
　　 第一部分：利用多位點Gateway技術構建系列慢病毒載體。<

2、br>　　 第二部分：攜帶組織特異啟動子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導人胚胎干細胞及其誘導分化的實驗研究。
　　 第三部分：慢病毒載體轉(zhuǎn)導食蟹猴胚胎干細胞及其誘導分化的實驗研究。
　　 第四部分：攜帶廣泛表達啟動子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導小鼠iPS細胞的初步實驗研究。
　　 第一部分利用多位點Gateway技術構建系列的慢病毒載體
　　 1.1目的:
　　 利用Gateway技術構建系列的慢病毒載體，通過病毒包裝技術

3、產(chǎn)生相應的慢病毒，高速離心后對病毒進行濃縮。目的在于通過操作簡便的Gateway技術快速、高效的構建系列的慢病毒載體。
　　 1.2方法:
　　 1.2.1通過LR結合反應，將攜帶報告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進行連接，構建2K7puro/promoter-reporter gene的表達載體。
　　

4、 1.2.2分別將表達載體質(zhì)粒與ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293FT細胞，收集及濃縮病毒。
　　 1.3結果:
　　 1.3.1將攜帶報告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進行連接，構建系列的2K7puro/promoter-reporter gene的表達載體

5、。將表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，得到單細菌克隆。
　　 1.3.2將2K7puro/promoter-reporter gene的表達載體與ViraPowerTM LentiviralPackaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細胞48h至72h后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光并有細胞融合現(xiàn)象，收集病毒上清液高速離心后，可見病毒顆粒沉淀在離心管底部。
　　 1.4結論:
　　 1.4.1成功構建系列的2K7puro/

6、promoter-reporter gene的慢病毒表達載體。1.4.2利用2K7puro/promoter-reporter gene的表達載體在293FT細胞成功包裝產(chǎn)生慢病毒。
　　 第二部分攜帶組織特異啟動子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導人胚胎干細胞及其誘導分化的實驗研究
　　 2.1目的:
　　 選取攜帶代表三胚層組織特異啟動子的2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP、2K7puro/aP2-hrGF

7、P和2K7puro/Albumin-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導人ES細胞，使用嘌呤霉素篩選后獲得攜帶不同外源基因的純化的人ES細胞，然后加入誘導試劑促進人ES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細胞，并進行相關的鑒定分析。
　　 2.2方法:
　　 2.2.1通過分次轉(zhuǎn)導的方法分別將三種慢病毒載體導入人ES細胞。轉(zhuǎn)導后第7天開始使用1-5μg/ml嘌

8、呤霉素篩選14天以獲得帶有不同表達質(zhì)粒的純化的人ES細胞。
　　 2.2.2加入各種誘導試劑促進人ES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細胞，并進行免疫組化和功能染色等的相關鑒定分析。
　　 2.3結果:
　　 2.3.1慢病毒轉(zhuǎn)導7天后，加入1-5μg/ml的嘌呤霉素開始篩選，可以觀察到有一定量的細胞死亡。篩選兩周后，可以得到抗嘌呤霉素的攜

9、帶外源質(zhì)粒的純化的人ES細胞。
　　 2.3.2加入各種誘導試劑促進人ES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，獲得了表達Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細胞，通過相關鑒定分析來源于轉(zhuǎn)導Tα1-α-tubulin hESC的熒光細胞證實為神經(jīng)元。
　　 2.4結論:
　　 2.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導人ES細胞，轉(zhuǎn)導后的人ES細胞經(jīng)過篩選獲得純化的細胞群，細胞生長和分化能力不受病毒轉(zhuǎn)導的

10、影響。
　　 2.4.2成功誘導攜帶含不同組織特異啟動子慢病毒載體的人ES細胞分化為表達綠色熒光的特定細胞類型，為以后分化機理和移植治療的研究提供了很好的工具。
　　 第三部分慢病毒載體轉(zhuǎn)導食蟹猴胚胎干細胞及其誘導分化的實驗研究
　　 3.1目的:
　　 選取攜帶代表三胚層組織特異啟動子的2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP、2K7puro/aP2-hrGFP和2K7puro/Album

11、in-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導食蟹猴ES(cmES)細胞進行純化后，然后加入誘導試劑促進cmES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細胞，并進行相關的鑒定分析。另外，通過體內(nèi)分化實驗驗證轉(zhuǎn)導2K7puro/EF1-α-hrGFP和2K7puro/EF1-α-dTomato的cmES細胞在體內(nèi)能夠分化為三胚層細胞類型。
　　 3.2方法:
　　 3.

12、2.1通過分次轉(zhuǎn)導的方法分別將三種慢病毒載體導入cmES細胞。轉(zhuǎn)導后第7天開始使用1-5μg/ml嘌呤霉素篩選14天，以獲得帶有不同表達載體的純化的cmES細胞。
　　 3.2.2加入各種誘導試劑促進cmES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、aP2和Albumin的綠色熒光細胞，并進行免疫組化和功能染色等的相關鑒定分析。
　　 3.2.3將1-2×107的hrGFP-cmES和dT

13、omato-cmES細胞注射到裸鼠背部皮F，2-3個月后處死并取出腫瘤，固定后送病理科石蠟切片檢查。部分組織做冰凍切片觀察腫瘤組織的熒光表達情況。
　　 3.3結果:
　　 3.3.1慢病毒轉(zhuǎn)導7天后，加入嘌呤霉素開始篩選，可以觀察到有一定量的細胞死亡。篩選兩周后，可以得到抗嘌呤霉素的攜帶外源質(zhì)粒的純化的cmES細胞。
　　 3.3.2加入各種誘導試劑促進cmES細胞向神經(jīng)元、脂肪細胞和肝細胞分化，獲得了表達Tα

14、1-α-tubulin和aP2的綠色熒光細胞，通過相關鑒定分析證實來源于轉(zhuǎn)導Tα1-α-tubulin和aP2的熒光細胞為神經(jīng)元和脂肪細胞。
　　 3.3.1 hrGFP-cmES和dTomato-cmES細胞形成的腫瘤組織包膜完整，可觀察到三胚層來源的細胞類型。熒光顯微鏡下觀察可見腫瘤組織均一性表達綠色或紅色熒光，未見明顯的熒光衰減現(xiàn)象。
　　 3.4結論:
　　 3.4.1成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導cmES細胞，經(jīng)過

15、篩選獲得純化的細胞群，細胞生長和分化能力不受病毒轉(zhuǎn)導的影響。
　　 3.4.2成功誘導攜帶不同外源基因的cmES細胞分化為表達綠色熒光的特定細胞類型，為以后分化機理和移植治療的研究提供了很好的工具。
　　 3.4.1轉(zhuǎn)導后的cmES細胞在體內(nèi)仍然保持多向分化能力，而且報告基因的表達未發(fā)生明顯的衰減，說明hrGFP和dTomato是一種理想的體內(nèi)示蹤劑。
　　 第四部分：攜帶廣泛表達啟動子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導小鼠iPS

16、細胞的初步研究
　　 4.1目的:
　　 首先通過對分子標記的檢測和體內(nèi)外分化實驗證明獲得的小鼠iPS細胞具有自我更新和多向分化潛能的特性。將2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導iPS細胞，用抗生素篩選后得到純化的表達dTomato和hrGFP的iPS細胞。目的在于證實利用Gateway技術構建的慢病毒載體能夠有效的感染iPS細胞。
　　 4.2方法

17、:
　　 4.2.1 iPS細胞生物學特性的分析：對iPS細胞的分子標記及體內(nèi)外分化能力進行檢測。
　　 4.2.2分別利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP兩種慢病毒載體轉(zhuǎn)導dTomato和hrGFP進入iPS細胞，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導情況。
　　 4.2.3抗生素篩選純化轉(zhuǎn)導后的iPS細胞。
　　 4.3結果:
　　 4.3.1 iPS細胞生

18、物學特性：iPS細胞表達Oct4、SSEA-1,在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細胞類型。
　　 4.3.2慢病毒轉(zhuǎn)導48h后，熒光倒置顯微鏡下可見部分iPS細胞表達紅色熒光或綠色熒光?？股睾Y選7-14滅后，可得到表達dTomato和hrGFP的陽性iPS細胞克隆。
　　 4.4結論:
　　 4.4.1小鼠iPS細胞具有與小鼠ES細胞相似的生物學特性。
　　 4.4.2成功利用慢病毒轉(zhuǎn)導iPS細胞，轉(zhuǎn)導后部分