鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的復(fù)合實(shí)時熒光定量RT-PCR方法的建立與評價.pdf

1、豬瘟 (Classical swine fever,CSF) 是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列入OIE疾病名錄 (OIE Listeddiseases),為須申報(bào)的(notifiable)動物傳染病.近年來,我國豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化,在臨床表現(xiàn)上趨于非典型化,主要表現(xiàn)為隱性帶毒和慢性感染,成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大隱

2、患.CSFV跟同屬的牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-2)、綿羊邊界病病毒(BDV)和長頸鹿瘟病毒(Pestivirus of giraffe)都屬于是黃病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒屬 (Pestivirus) 的成員,由于瘟病毒屬其它成員大都可以感染豬,與CSFV存在血清學(xué)交叉反應(yīng),因此給豬瘟診斷造成一定干擾.此外,豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我國的大規(guī)模應(yīng)用,為控制豬瘟起到了重要

3、作用,但同時也給傳統(tǒng)的診斷方法對CSFV野毒感染豬和疫苗接種豬的鑒別診斷帶來較大困難. 本研究旨在建立一種復(fù)合熒光定量RT-PCR方法,用于CSFV野毒株與兔化弱毒疫苗株的鑒別診斷.通過對 GenBank 中公布的34株CSFV野毒和弱毒疫苗株基因組序列的比較分析,在其5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對針對CSFV的通用引物和兩條分別針對不同基因亞群的CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株的特異性TaqMan水解探針,建立了一種能區(qū)分CSFV野毒

4、株和兔化弱毒疫苗株的敏感、特異、重復(fù)性好的復(fù)合熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法.該方法能將我國大陸流行的不同基因亞群(1.1、2.1、2.2和2.3基因亞群)的CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株完全區(qū)分開來,在10<'6>-10<'1>拷貝/μL 范圍內(nèi),對CSFV野毒和兔化弱毒疫苗標(biāo)準(zhǔn)品模板的檢測具有良好的線性關(guān)系,分別可檢測到初始模板中41.8個(野毒)或81.5個(弱毒)拷貝的病毒RNA,與本實(shí)驗(yàn)室建立的復(fù)合RT-套式PCR(RT

5、-nPCR)的敏感性相近,二者對152份不同樣品(包括細(xì)胞培養(yǎng)物和臨床現(xiàn)地樣品)檢測陽性符合率分別為96.2﹪(野毒)和100﹪(兔化弱毒疫苗).應(yīng)用復(fù)合熒光定量RT-PCR對其中106份現(xiàn)地樣品檢測發(fā)現(xiàn),野毒陽性率為30.2﹪(32/106). 應(yīng)用本方法對人工感染10<'6>TCID<,50>豬瘟石門強(qiáng)毒的豬只感染后0～14d全血中CSFV RNA進(jìn)行了定量檢測,揭示了CSFV在豬體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)變化,同時發(fā)現(xiàn),人工感染豬在感

6、染后第2天在其全血中就可檢測到病毒RNA,而同居感染豬在出現(xiàn)豬瘟臨床癥狀前3～4d可從其全血中檢出病毒RNA. 應(yīng)用本方法對8份豬瘟兔化細(xì)胞疫苗原液效價的檢測,證實(shí)本方法與兔體反應(yīng)熱法在疫苗效價測定上具有良好的相關(guān)性,初步確定細(xì)胞疫苗樣品中病毒RNA的含量為 2.23×10<'7>拷貝/mL,(相當(dāng)于5×10<'4>RID<,50>)以上時才可以用于制苗. 本方法可以及早對豬瘟爆發(fā)做出準(zhǔn)確快速診斷,防止疫情蔓延;可以將C