豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗效檢替代方法和豬瘟病毒鑒別檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接觸性、多系統(tǒng)出血性豬傳染病。我國對(duì)于豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗大規(guī)模免疫為主。但是點(diǎn)狀散發(fā)的豬瘟疫情仍時(shí)有發(fā)生，并且在我國分布廣泛，流行態(tài)勢(shì)日趨復(fù)雜。
　　 在這種情況下需要對(duì)疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別檢測(cè)，調(diào)查豬場(chǎng)中豬瘟隱性感染或持續(xù)性感染的情況，同時(shí)通過一定的方法提高

2、豬瘟兔化弱毒疫苗的質(zhì)量。本研究旨在建立豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗的效檢替代方法以及對(duì)豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)方法，為我國豬瘟的防控工作提供幫助。(1)以兔體定型熱法進(jìn)行豬瘟疫苗效檢受試驗(yàn)兔個(gè)體差異和飼養(yǎng)環(huán)境的影響很大。本研究將待檢疫苗系列稀釋后接種易感細(xì)胞，使用RT-nestPCR、RT-PCR和抗原捕獲ELISA三種方法檢測(cè)細(xì)胞感染后產(chǎn)生的子代病毒。不同疫苗所能夠檢測(cè)到的陽性稀釋度的高低可以反映疫苗中的有

3、感染性病毒粒子的濃度，以最高陽性稀釋度作為疫苗效價(jià)的指標(biāo)。使用該方法對(duì)12批豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗和3批豬瘟兔化弱毒牛睪丸疫苗進(jìn)行效檢并與兔體定型熱法效檢的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，ST傳代細(xì)胞源疫苗的陽性稀釋度達(dá)到10-6～10-7，每頭份含2.6×104～3.0×104 RID。牛睪丸疫苗的陽性稀釋度≤10-4，每頭份含7.0×103～8.0×103 RID，本方法效檢的結(jié)果與兔體定型熱法存在一定的相關(guān)性，并且能夠反映疫苗中有

4、感染性病毒粒子的多少。(2)在豬瘟兔化弱毒基因組3'端12nt多聚T堿基插入?yún)^(qū)域兩側(cè)的保守區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)一對(duì)外圍引物和一對(duì)內(nèi)圍引物。豬瘟兔化弱毒的擴(kuò)增片段因包含有多聚T堿基插入片段所以要長于豬瘟野毒的擴(kuò)增片段。RT-nestPCR方法對(duì)于豬瘟兔化弱毒C株和豬瘟石門毒的檢測(cè)極限分別為0.032pg和0.045pg病毒RNA。特異性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法能夠有效檢測(cè)各類型的豬瘟病毒，對(duì)非豬瘟的其它病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。對(duì)400份健康豬

5、扁桃體臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)得到4份豬瘟兔化弱毒和12份豬瘟野毒陽性樣本。對(duì)14批豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測(cè)表明所有疫苗均可檢測(cè)到豬瘟兔化弱毒并且未發(fā)現(xiàn)存在豬瘟野毒污染。所建立的RT-nestPCR鑒別檢測(cè)方法能夠有效區(qū)分豬瘟兔化弱毒和豬瘟野毒，特異性好、靈敏度高。(3)通過對(duì)47條豬瘟病毒、7條牛病毒性腹瀉病毒和3條邊界病毒基因組全序列比對(duì)，分別在豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3條TaqMan-MGB探針和配套引物。采用正

6、交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)上、下游引物濃度、探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。特異性試驗(yàn)表明該方法在同時(shí)鑒別檢測(cè)豬瘟兔化弱毒、不同基因型的豬瘟野毒和BVDV時(shí)均能在相應(yīng)熒光通道觀察到特異性擴(kuò)增曲線，各通道間無熒光干擾，對(duì)其它病毒的檢測(cè)則無擴(kuò)增曲線。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不大于1％。敏感性試驗(yàn)表明該方法對(duì)豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒Shimen株、BVDV_Oregon株的檢測(cè)極限分別為31.4拷貝/μL、15.8拷貝/μL、32.5拷貝/μL。

7、對(duì)400份臨床組織樣本檢測(cè)得到4份豬瘟兔化弱毒陽性、12份豬瘟野毒陽性、22份BVDV陽性，對(duì)14批商品化豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測(cè)表明均能檢測(cè)到豬瘟兔化弱毒，并且無豬瘟野毒和BVDV污染，與其它檢測(cè)方法的符合率達(dá)到95％以上。本方法可以同時(shí)定量檢測(cè)和區(qū)分豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV，可以用于區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物，同時(shí)還可以對(duì)豬瘟疫苗的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。(4)為了對(duì)我國種豬場(chǎng)內(nèi)豬瘟病毒的隱性感染情況進(jìn)行了調(diào)查。對(duì)采集自中國北方部分地區(qū)

8、種豬場(chǎng)臨床健康豬的400份扁桃體進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)豬瘟野毒陽性樣本進(jìn)行病毒分離，成功得到11株豬瘟病毒分離株?；贓2全基因序列的遺傳進(jìn)化分析表明這11株豬瘟病毒全部屬于2.1a亞型。推導(dǎo)氨基酸序列的分析表明，這11株病毒在E2蛋白抗原結(jié)構(gòu)域中的部分位點(diǎn)發(fā)生了一致的、與其它豬瘟病毒分離株都不同的變異。
　　 本研究通過所建立的RT-nestPCR和三重?zé)晒舛縍T-PCR鑒別檢測(cè)方法對(duì)我國北方地區(qū)種豬場(chǎng)內(nèi)豬瘟病毒隱性感染進(jìn)行了調(diào)查，并