非洲豬瘟病毒VP72基因檢測方法的建立及VP73蛋白研究.pdf

1、非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是一種強(qiáng)傳染性的病毒，可引起家豬的急性、致死性傳染病。對養(yǎng)豬業(yè)可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究成功建立了ASFV實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，并制備了VP73主要抗原表位區(qū)融合蛋白的多克隆抗體，為非洲豬瘟VP73蛋白后續(xù)免疫學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為了建立一套檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)的實(shí)時熒光定量PCR方法，根據(jù)GenBank公布的23株編碼ASFV結(jié)構(gòu)蛋白

2、p72的基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化退火溫度、mg2+濃度和引物探針濃度，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行重復(fù)性、敏感性、特異性試驗(yàn)，并檢測樣品。結(jié)果顯示，優(yōu)化的退火溫度為60℃，mg2+終濃度為4mmol/L，引物探針終濃度分別為0.8μmol/L和0.3μmol/L。重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于1.3％，敏感性試驗(yàn)最低能夠檢測到10拷貝的質(zhì)粒，以其他5種豬病病毒和ASFV質(zhì)粒為模板進(jìn)行特異性試驗(yàn)，只有ASFV質(zhì)粒出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，建立的實(shí)時熒

3、光定量PCR方法是快速、靈敏、特異的檢測ASFV的方法。
　　構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-VP73，將pET32a-VP73轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，VP73蛋白主要抗原表位區(qū)可穩(wěn)定高效的表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG終濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高，表達(dá)蛋白為融合蛋白，分子量約為42kD。蛋白純化后，經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot鑒定，確定表達(dá)產(chǎn)物為非洲豬瘟病毒VP7