接受GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的中性粒細胞程序化細胞死亡和線粒體及相關基因表達的研究.pdf

1、目的：中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）在機體固有性免疫應答中具有重要作用，它是一把雙刃劍，其胞漿內富含的細胞毒性物質既可殺傷外來入侵的病原微生物，也可造成自身組織細胞的損傷。中性粒細胞通過程序化細胞死亡被吞噬細胞吞噬清除，從而避免炎癥反應擴大化，減少自身組織細胞損傷。Stephan等在研究GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激人中性粒細胞時，發(fā)現(xiàn)Siglec-9介導了caspase-

2、3、caspase-8依賴性和caspase-3、caspase-8非依賴性的PMN死亡，兩者都有活性氧簇（ROS）的參與，并且caspase-3、caspase-8非依賴性的PMN死亡具有非凋亡程序化細胞死亡的形態(tài)學特征[1]。本課題對GM-CSF+Anti-Siglec-9（抗表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白樣凝集素-9（anti-surface molecule sialic acid-binding immunoglobulin-

3、like lectin-9，Anti-Siglec-9）刺激人中性粒細胞程序化細胞死亡進行了形態(tài)學觀察，并進一步研究其分子機制，探討NDP（NADH-ubiquinone oxidoreductase Fe-S protein，complexⅠ）、 SDH（succinate dehydrogenase flavoprotein subunit，complexⅡ）、Cyt P450（Cytochrome P450，complexⅢ）、C

4、OXs（cytochrome c oxidase subunit，complexⅣ）、Smac（線粒體蛋白）、 AIF（Apoptosis induced factor）、 Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、caspase-9、IAP（inhibitor of apoptosis protein）和線粒體在這種死亡形式中發(fā)揮的作用，為揭示這種中性粒細胞死亡過程中信號轉導的途徑并

5、發(fā)展有效的免疫學措施以調控炎癥奠定實驗和理論基礎。 方法：分離、純化正常人外周血中性粒細胞，在分別加入GM-CSF、Antimycin A（抗霉素A）、Anti-Siglec-9、GM-CSF+Anti-Siglec-9和不加任何刺激物情況下進行培養(yǎng)，構建致炎細胞因子（proinflammatory cytokine）、呼吸鏈阻斷、表面分子唾液酸性粘合免疫球蛋白樣凝集素-9結扎（Siglec-9ligation）、程序化細胞死亡

6、和自發(fā)性凋亡的細胞模型。運用光鏡和激光共聚焦顯微鏡對不同培養(yǎng)條件下產生的細胞模型進行形態(tài)學研究；低分子量瓊脂糖電泳顯示DNA片斷化；提取程序化細胞死亡組和自發(fā)性凋亡組中性粒細胞蛋白，SDS-PAGE觀察各組蛋白表達情況；用抗AIF單克隆抗體通過western blotting技術檢測并比較AIF在不同死亡模型中的表達狀態(tài)；RT-PCR技術檢測NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9、

7、IAP的mRNA表達水平。 結果：1.激光共聚焦掃描顯微鏡的結果顯示，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激組的中性粒細胞線粒體形態(tài)與功能發(fā)生了變化，且與自發(fā)性凋亡組在細胞核染色和線粒體的結構上都有十分明顯的差異。2.GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激中性粒細胞9小時后，激光共聚焦掃描顯微鏡顯示：細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，絕大多數(shù)中性粒細胞的多葉核融合成單葉核，胞漿內諸多空泡樣結構，但細胞膜保持完整性及無凋亡小體，不

8、同于壞死和自發(fā)性凋亡。3.低分子量DNA瓊脂糖電泳顯示，自發(fā)性凋亡組生成200 bp整數(shù)倍的DNA梯形條帶（DNA ladder），GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激的程序化細胞死亡組出現(xiàn)短而彌散的DNA電泳譜帶，主要分布在分子量較大的區(qū)段。4.不同時間段提取中性粒細胞蛋白，用抗AIF單克隆抗體對不同死亡模型進行western blotting分析。 結果顯示：隨著培養(yǎng)時間延長，GM-CSF+Anti-Siglec-9

9、可以刺激中性粒細胞AIF具有促中性粒細胞死亡的作用，其表達上調將引起中性粒細胞死亡加速。5. RT-PCR分析NDP、SDH、Cyt P450、COXs、Smac、AIF、Apaf-1、caspase-9和IAP的mRNA表達水平。實驗結果顯示：GM-CSF組IAP基因的表達上調和SDH基因的表達下調（P<0.01），Antimycin A組NDP、SDH、Smac和caspase-9四個基因的表達均上調（P<0.01）。Anti-Si

10、glec-9組Smac和caspase-9兩個基因的表達均上調（P<0.01），GM-CSF+Anti-Siglec-9組與自發(fā)性凋亡組比較Cyt P450、COXs、Smac、AIF、caspase-9五個基因表達均明顯上調（P<0.01）。6.激光共聚焦顯示的AIF表達情況，發(fā)現(xiàn)與自發(fā)性凋亡組比較，GM-CSF+Anti-Siglec-9刺激組的中性粒細胞上調AIF的表達水平（P<0.01）。 結論：1.GM-CSF+Ant

11、i-Siglec-9可以誘導人中性粒細胞產生程序化細胞死亡，而且其死亡信號的傳導不同于傳統(tǒng)的凋亡。2.線粒體膜通透性增加導致跨膜電位降低可能是GM-CSF+Anti-Siglec-9誘導中性粒細胞不同于傳統(tǒng)凋亡的程序化細胞死亡的重要分子基礎。3.Cyt P450、 COXs、 Smac、 AIF、 caspase-9參與GM-CSF+Anti-Siglec-9誘導人中性粒細胞不同于傳統(tǒng)凋亡的程序化細胞死亡的線粒體信號傳導途徑。4.NDP