ONO-AE-248誘發(fā)中性粒細(xì)胞非凋亡性程序化死亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：在建立蛋白質(zhì)組分析方法的基礎(chǔ)上，運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法，對(duì)前列腺素E2受體EP3的選擇性激動(dòng)劑ONO-AE-248誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)非凋亡性程序化細(xì)胞死亡(non-apoptoticprogrammedcelldeath)和正常中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，分析鑒定在這兩種不同的生物學(xué)過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并動(dòng)態(tài)觀察這些差異蛋白質(zhì)在PMN非凋亡性

2、程序化細(xì)胞死亡過(guò)程中表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特征，以期為探討“非凋亡性程序化死亡”這種新的細(xì)胞死亡方式的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為豐富細(xì)胞死亡的多樣性奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為重新認(rèn)識(shí)和定位中性粒細(xì)胞在固有性免疫應(yīng)答中的地位和作用提供新的思路。 方法：采用梯度離心法分離、純化正常人外周血中性粒細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/ml，以每孔1ml接種于24孔培養(yǎng)板中。將分離的PMN隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組中每孔均加入ONO-AE-248(終濃度

3、為5×10-5mol/ml)，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃，CO2含量5％，濕度90％的CO2培養(yǎng)箱中分別孵育培養(yǎng)2h、6h、12h、24h，構(gòu)建PMN非凋亡性程序化死亡和自發(fā)性凋亡的細(xì)胞模型。在各時(shí)間點(diǎn)分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PMN的全細(xì)胞蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，雙向電泳(一向采用pH4-7的固相pH梯度(IPG)等電聚焦，二向采用濃度為10％的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白

4、，銀染后獲得雙向電泳圖譜。凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖譜，根據(jù)IPG膠條的線性梯度和標(biāo)準(zhǔn)分子量marker確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI和MW，利用PDQuest2-DE分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PMN的蛋白質(zhì)電泳圖譜進(jìn)行差異分析，并初步篩選出培養(yǎng)12h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的20個(gè)具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。切下篩選出的20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行檢測(cè)，獲得各蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜和荷質(zhì)比，結(jié)合2-DE圖

5、譜中各蛋白質(zhì)的pI和MW，利用Mascot和ProteinProspector軟件進(jìn)行匹配檢索，并在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中定性查詢(xún)，初步鑒定培養(yǎng)12h時(shí)，PMN非凋亡性程序化細(xì)胞死亡和自發(fā)性凋亡的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并利用PDQuest2-DE軟件對(duì)其中兩種重要的差異蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。 結(jié)果：1.雙向電泳結(jié)果顯示，ONO-AE-248誘發(fā)的PMN非凋亡性程序化死亡在培養(yǎng)的不同時(shí)間(2h、6h、12h、24h)蛋白

6、質(zhì)表達(dá)圖譜存在明顯差異。 2.ONO-AE-248誘發(fā)的PMN非凋亡性程序化死亡與PMN自發(fā)性凋亡過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)存在顯著差異。 3.利用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)鑒定，確定了12個(gè)PMN非凋亡性程序化死亡與自發(fā)性凋亡的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，它們分別為：(1)角蛋白(CK-10)(2)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(YALI0D26950g)(3)β-內(nèi)酰胺酶樣前體(SfriDRAFT_3533)(4)B2N18.040(5)ATP結(jié)合蛋白(st

7、sE)(6)氧化還原酶(oxidoreductase)(7)轉(zhuǎn)錄因子4復(fù)合體(CCR4)(8)鐵氧化還原蛋白(RPEDRAFT_2200)(9)骨髓巨噬細(xì)胞cDNA編碼蛋白(BonemarrowmacrophagecDNA)(10)陽(yáng)離子流出蛋白(MA_2085)(11)含有CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)(12)組胺酸磷脂酶(DVU_2490)。 4.PDQuest2-DE軟件分析顯示，12種初步鑒定的差異蛋白質(zhì)中

8、僅在ONO-AE-248組PMN中表達(dá)的是：角蛋白、胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、β-內(nèi)酰胺酶樣前體；僅在自發(fā)性凋亡的PMN中表達(dá)的是：氧化還原酶、ATP結(jié)合蛋白、B2N18.040、轉(zhuǎn)錄因子4復(fù)合體、鐵氧化還原蛋白；兩組均有表達(dá)但表達(dá)量不同的是：組胺酸磷脂酶(實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)比對(duì)照組低800％)、陽(yáng)離子流出蛋白(實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)比對(duì)照組高96％)、骨髓巨噬細(xì)胞cDNA編碼蛋白(實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)比對(duì)照組低31％)、ASC(實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)比對(duì)照組低85％)

9、。 5.對(duì)組胺酸磷脂酶(DVU_2490)和含有CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)的表達(dá)進(jìn)行時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)曲線在對(duì)照組均呈峰形，于12h表達(dá)達(dá)到最大值后逐漸下降；而在實(shí)驗(yàn)組DVU_2490的表達(dá)于2h至12h呈現(xiàn)持續(xù)低表達(dá)，于12h表達(dá)即快速下降，至24h已檢測(cè)不到該蛋白的表達(dá)；ASC在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)也呈現(xiàn)較低水平，在6h即達(dá)高峰，隨后表達(dá)逐漸下降，24h時(shí)僅檢測(cè)到微量表達(dá)。 結(jié)論：1.O

10、NO-AE-248誘發(fā)的中性粒細(xì)胞非凋亡性程序化死亡隨時(shí)間變化伴隨有蛋白質(zhì)組的明顯改變。 2.ONO-AE-248誘導(dǎo)的人PMN非凋亡性程序化細(xì)胞死亡與PMN的自發(fā)性凋亡的蛋白質(zhì)組存在顯著差異，提示兩種死亡方式發(fā)生的分子機(jī)制有較大差異。 3.ONO-AE-248誘導(dǎo)人PMN產(chǎn)生非凋亡性程序化細(xì)胞死亡的機(jī)制可能涉及到多種轉(zhuǎn)錄因子、催化代謝的酶類(lèi)和細(xì)胞骨架蛋白。 4.ASC引發(fā)的caspase-9途徑在中性粒細(xì)胞非凋