尸體心肌組織蛋白質(zhì)時序性降解代謝組學(xué)推斷死亡時間的研究.pdf

1、目的和意義：由于尸體受到自身和周圍各種環(huán)境因素的綜合影響，致使有效的推斷PMI，迄今為止，沒有一種方法被公認精確，故此，探究精確推斷PMI的方法，已成為法醫(yī)學(xué)的緊要任務(wù)和艱巨挑戰(zhàn)。隨著死后時間的延長，尸體宏觀形態(tài)上，發(fā)生劇烈且持續(xù)性的死后變化，追本溯源，本質(zhì)在于多因素作用下，自身生化物質(zhì)的改變，即功能性、結(jié)構(gòu)性大分子生物物質(zhì)單向性降解，產(chǎn)生游離性小分子物質(zhì)的過程?；谛呐K為胸腔和心包膜腔內(nèi)相對獨立的實質(zhì)內(nèi)臟器官，心肌組織富含蛋白質(zhì)、核酸

2、等生物大分子，在本研究中，借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)，對所檢測的小分子有機物進行快速準確的定性定量分析，通過心肌組織氨基酸類含量時序性變化規(guī)律及其與推斷PMI相關(guān)性，探討其準確量化地推斷PMI的可行性。
　　材料與方法：汕頭市屠宰場，成年家豬10頭，體重150kg±20kg，均放血處死，提取全心臟組織（包括心包膜），分別置于恒溫、恒濕的人工智能氣

3、候箱中，模擬自然腐敗，在0h-144h間每隔12h一個時間點，按“六定”標(biāo)準，規(guī)范化取材，8個樣本/時間點。
　　GC-MS(安捷倫，美國)檢測：心尖近左心室外膜側(cè)、避開血管，按時間點取0.1g心肌組織，以80％乙醇溶液（1:10）固定8h，以500μL0.1mol/L鹽酸酸化、勻漿機勻漿，5000r/min離心30分鐘，提取上清液400μL，加入乙腈去蛋白后，提取上清液50μL，加入20μL正亮氨酸，做為內(nèi)標(biāo)，混勻吹干。加50μ

4、L的吡啶和50μL MTBSFA，在微波爐中火下衍生化，持續(xù)2分鐘；靜置1h后，取1μL上述樣品，進行上機檢測，利用GC/MS自帶的數(shù)據(jù)分析工作站，進行定性定量分析，識別各氨基酸并導(dǎo)出其參數(shù)，以各氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)（正亮氨酸）峰面積的比值做為系數(shù)，計算各氨基酸相對含量。
　　統(tǒng)計分析
　　簡單線性回歸(Linear Regression，LR)、單因素方差分析Bonferroni法兩兩比較均值、逐步多元線性回歸(Stepwi

5、se Multiple Linear Regression,SMLR)，P<0.05為顯著性差異，推導(dǎo)多種氨基酸推測PMI線性擬合公式，采用SPSS進行。采用Simca-P13.0進行多維統(tǒng)計分析，描繪整體趨勢及代謝輪廓，包括偏最小二乘法(Partial Least Square, PLS)、主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。用GraphPad Prism5統(tǒng)計圖標(biāo)軟件制圖。
　　結(jié)

6、果：
　　1、80%乙醇與甲醇固定-萃取液對比：30℃60h組檢出氨基酸種類差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05，兩種固定方法的效果相同。
　　2、80%乙醇固定時間：固定8h后，各氨基酸相對含量量與種類基本不再隨固定時間的延長而變化（小幅度上下波動，不影響量級），80%乙醇固定兼萃取時間最好超過8h-72h或以上。
　　3、80%乙醇固定豬心臟組織，GC-MS檢測結(jié)果，各溫度組氨基酸相對含量整體上，與PMI呈線性增加趨勢：

7、
　?、?0℃組可識別峰氨基酸含量與PMI的主成分分析(PCA)：模型R2X=0.904，Q2=0.559，所測10種氨基酸120h呈明顯增高線性趨勢，最佳線性“窗口期”為36h-120h，0h-36h增幅不明顯，呈前“平臺期”；120h后，組內(nèi)離散程度大，但依然呈現(xiàn)增長趨勢，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示20℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI最佳“窗口期”為死后36h-120h之間。PLS分析：R2X=0.802，R2Y=0.96

8、9，Q2=0.962。Y預(yù)測圖的回歸曲線方程：Y20℃=0.995689x+0.264853(R2=0.969199)。大部分氨基酸含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　20℃組各氨基酸綜合多元線性逐步回歸方程：YPMI=14.130+20.259X纈氨酸+26.008X丙氨酸+34.102X甘氨酸+25.946X谷氨酸+101.903X甲硫氨酸(R2=0.980，P<0.005，模

9、型F=320.690， SE=5.3978)。
　?、?5℃組可識別峰氨基酸含量與PMI的主成分分析(PCA)：R2X=0.897，Q2=0.756，大部分氨基酸從24h開始，隨著PMI延長，增長趨勢明顯，總體“窗口期”比20℃組前移12h，“窗口期”為24-120h，0-24h呈前“平臺期”，120h后，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示25℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI的最佳“窗口期”為死后24h-120h之間。PLS分析:R2

10、X=0.862，R2Y=0.951，Q2=0.940。Y預(yù)測圖的回歸曲線方程：Y25℃=0.998566x+0.682288(R2=0.951206)。大部分氨基酸的含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)較為明顯的線性關(guān)系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　各氨基酸綜合多元線性逐步回歸分析方程：YPMI=31.092+11.982X亮氨酸+57.449X甲硫氨酸+21.895X甘氨酸(R2=0.963，P<0.005，模型F=168

11、.204，SE=7.397)。
　?、?0℃組氨基酸與PMI的主成分分析(PCA)：R2X=0.904，Q2=0.769，總體“窗口期”比25℃組前移12h，“窗口期”為0-120h，不出現(xiàn)明顯的前平臺期，120h后，相對前階段波動性較大，但依然呈現(xiàn)增長趨勢，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示30℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI的最佳“窗口期”為死后12h-120h之間。PLS分析:R2X=0.895，R2Y=0.978，Q2=0.9

12、15。Y預(yù)測圖的回歸曲線方程：Y30℃=1x+6.27635e-006(R2=0.977632)。大部分氨基酸的含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)較為明顯的線性關(guān)系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　各氨基酸綜合多元線性逐步回歸分析方程:YPMI=1.209+8.504X谷氨酸+10.640X絡(luò)氨酸(R2=0.984，P<0.005，模型F=474.793，SE=5.71475)。
　　⑷以公式V=(132h氨基酸含量-0

13、h氨基酸含量)/132計算氨基酸平均生成速率V20℃、V25℃、V30℃，其中V25℃:V20℃≈2～2.5:1, V30℃:V20℃≈3～5:1，即30℃組的生成速度為20℃組的3到5倍，符合范特霍夫規(guī)則(Van't Hoff's rule, or the rule of ten) K(T+10k)/K(T)≈2～4，即溫度每升高10℃/k，化學(xué)反應(yīng)速率增加2～4倍，提示尸體心肌組織蛋白質(zhì)降解為其最小結(jié)構(gòu)性功能分子氨基酸的生成速率與環(huán)

14、境溫度存在符合范特霍夫規(guī)則的規(guī)律性。
　　結(jié)論：
　　1、利用GC-MS檢測80%酒精作為固定液兼萃取液的心臟組織氨基酸相對含量，呈明顯的時序性增高變化規(guī)律，推斷PMI“窗口期”為死后120h，預(yù)測誤差5～8h左右，具有較好的應(yīng)用前景。
　　2、環(huán)境溫度溫度作為影響推斷PMI的重要因素，可明顯加快死后心肌組織降解生成生成氨基酸的速率，V30℃:V20℃≈3～5:1，提示尸體心肌組織蛋白質(zhì)降解最小結(jié)構(gòu)性功能分子氨基酸的生