結(jié)核分枝桿菌對中性粒細(xì)胞功能和共刺激分子表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性感染性疾病。由于結(jié)核病導(dǎo)致的組織損傷主要由機(jī)體的免疫系統(tǒng)介導(dǎo),而且在結(jié)核病患者體內(nèi)往往存在Th1型免疫應(yīng)答受抑, Th2型免疫應(yīng)答水平異常升高的現(xiàn)象,結(jié)核病也被認(rèn)為是一種免疫紊亂性疾病,機(jī)體免疫應(yīng)答的方向和水平在很大程度上決定著結(jié)核病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。
　　中性粒細(xì)胞作為機(jī)體重要的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞,是機(jī)體抵抗病原微生

2、物感染的第一道防線。早期的研究認(rèn)為中性粒細(xì)胞僅作為吞噬細(xì)胞在Mtb感染的早期參與抗結(jié)核病的固有免疫應(yīng)答,但近年來的研究顯示中性粒細(xì)胞還參與了結(jié)核病適應(yīng)性免疫的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié),對結(jié)核病免疫的發(fā)展有重要影響。
　　共刺激分子是一類表達(dá)于免疫細(xì)胞及免疫相關(guān)細(xì)胞上的蛋白,其介導(dǎo)的信號即為共刺激信號。共刺激信號對機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)是雙向的,通過正、負(fù)共刺激信號的調(diào)節(jié)使機(jī)體維持免疫平衡狀態(tài)。正性共刺激分子CD28、CD80、CD86等能激活T細(xì)胞

3、,使其增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng),抵抗外來入侵的病原微生物;負(fù)性共刺激分子程序性死亡因子1(Programmed death1,PD-1)、程序性死亡因子1配體(Ligand of Programmed death1,PD-L1)則抑制T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子,抑制免疫應(yīng)答反應(yīng),防止過度的免疫損傷和自身免疫性疾病的發(fā)生,有利于維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)。近年來有研究顯示中性粒細(xì)胞表面也會(huì)有共刺激分子的表達(dá),提示我們中性粒細(xì)胞表達(dá)

4、共刺激分子可能對機(jī)體抗結(jié)核病免疫有一定影響。
　　本研究通過對比分析活動(dòng)性肺結(jié)核患者和健康人外周血中性粒細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)水平及功能的差異,探討結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)特性及細(xì)胞功能的改變。并通過Mtb體外感染的方法驗(yàn)證了Mtb對中性粒細(xì)胞功能和共刺激分子表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上,本研究采用特異性單抗阻斷PD-1/PD-L1信號途徑的方法,初步探討了該負(fù)性共刺激信號對中性粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。
　　第一

5、部分結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞的功能及共刺激分子的表達(dá)特性
　　目的:
　　通過分析結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)水平及細(xì)胞功能的變化,探討結(jié)核病患者免疫功能異常與共刺激分子的關(guān)系。
　　方法:
　　收集30例活動(dòng)性肺結(jié)核患者和20例健康體檢者的外周血,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)水平,CD62L的表達(dá)水平以及呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS的水平;用硝酸還原酶法檢測中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NO;用Trans

6、well裝置檢測中性粒細(xì)胞對IL-8的趨化能力。
　　結(jié)果:
　　與健康對照組相比,結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞具有以下特征:
　　(1)CD86表達(dá)顯著降低(P<0.05),PD-L1分子表達(dá)顯著增加(P<0.01),而CD28、CD80、HLA-DR和PD-1均無顯著性變化(P>0.05);
　　(2)經(jīng)PMA刺激后,呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS和NO水平顯著提高(P<0.05);
　　(3)CD62L表達(dá)無顯著

7、性差異(P>0.05);
　　(4)對IL-8的趨化能力顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞正性共刺激分子CD86表達(dá)下降,負(fù)性共刺激分子PD-L1表達(dá)升高,產(chǎn)生ROS和NO的量明顯增高,趨化能力有所降低。由此提示,共刺激分子表達(dá)失調(diào)可能會(huì)影響中性粒細(xì)胞功能。
　　第二部分結(jié)核分枝桿菌感染對中性粒細(xì)胞的功能及共刺激分子表達(dá)的影響
　　目的:
　　分析Mtb感染后中性粒細(xì)胞共

8、刺激分子的表達(dá)水平及細(xì)胞功能的變化,探討Mtb感染對中性粒細(xì)胞的功能及共刺激分子表達(dá)的影響
　　方法:
　　收集20例健康體檢者的外周血,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測感染Mtb后中性粒細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)水平,呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS和CD62L的表達(dá)水平以及中性粒細(xì)胞的凋亡率;用硝酸還原酶法檢測感染Mtb后中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NO;使用Transwell裝置檢測感染Mtb后中性粒細(xì)胞對IL-8的趨化能力;用菌落計(jì)數(shù)(CFU)的方法觀察中性

9、粒細(xì)胞對Mtb的殺菌能力。
　　結(jié)果:
　　(1)與對照組相比,加入Mtb感染后中性粒細(xì)胞具有以下特征:
　　①CD28、CD80、CD86、PD-1和PD-L1表達(dá)水平顯著提高(P<0.01),兩組中HLA-DR表達(dá)無顯著性差異(P>0.05);
　?、诋a(chǎn)生ROS和NO的水平顯著提高(P<0.01);
　?、跜D62L表達(dá)水平顯著降低( P<0.01);
　?、軐L-8的趨化能力顯著提高( P<0

10、.05)。
　　(2)MS和Mtb感染均可顯著上調(diào)中性粒細(xì)胞的凋亡水平,但與MS組相比,Mtb感染的中性粒細(xì)胞凋亡率更低(P<0.01)。
　　(3)中性粒細(xì)胞能夠有效地殺傷無致病性的MS,卻不能殺傷有毒性的Mtb,導(dǎo)致Mtb在細(xì)胞內(nèi)繁殖。
　　結(jié)論:
　　1、Mtb感染能有效活化中性粒細(xì)胞,同時(shí)伴隨一系列共刺激分子的表達(dá)改變,但這些共刺激分子的變化是否與中性粒細(xì)胞的功能改變相關(guān)需要進(jìn)一步的研究。
　　2、

11、Mtb體外感染導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞共刺激分子的改變與結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)模式不完全一致,具體原因有待對結(jié)核病患者感染局部的中性粒細(xì)胞功能進(jìn)行檢測分析后確定。
　　第三部分體外阻斷PD-1/PD-L1通路對中性粒細(xì)胞功能的影響
　　目的:
　　通過在體外對PD-1/PD-L1信號通路進(jìn)行干預(yù),探討該負(fù)性共刺激信號對中性粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　收集15例健康體檢者的外周血,

12、加入抗PD-L1單克隆抗體阻斷PD-1/PD-L1通路后,再加入Mtb感染30min,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞ROS水平和CD62L的表達(dá)以及通過transwell趨化裝置檢測中性粒細(xì)胞趨化能力的改變。
　　結(jié)果:
　　與Mtb感染組相比,體外阻斷PD-1/PD-L1信號通路后,中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS水平顯著增加(P<0.05),CD62L的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),中性粒細(xì)胞對IL-8的趨化能力提高(P<0.05