二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)鑒定食管鱗癌N-連接糖蛋白差異表達(dá)譜.pdf

1、背景:EC(Esophageal Cancer, EC)是世界上八大常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在中國(guó),EC的主要組織學(xué)類型為食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC),約占所有EC的90％。河南太行山區(qū)的林州市及其毗鄰的輝縣、安陽(yáng)等地區(qū)是世界及我國(guó)EC發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一,目前仍是該地區(qū)腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。EC的重要特征之一是高死亡率,大多數(shù)病人在臨床上確診之后的生存時(shí)間

2、不超過(guò)一年,其五年生存率僅為8%。提高EC治療效果的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療,食管原位癌和粘膜內(nèi)癌患者的術(shù)后五年生存率可分別達(dá)到100%和95%。然而,目前尚無(wú)早期診斷和預(yù)警的有效措施。因此,闡明ESCC的發(fā)病因素及多階段演進(jìn)分子機(jī)制,篩選和鑒定與癌變密切相關(guān)的預(yù)警分子,找尋新的治療靶點(diǎn)和更有效治療方法,對(duì)建立高危人群監(jiān)測(cè)和ESCC早期診斷的生物標(biāo)志物和方法,從而降低其發(fā)病率和死亡率,具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。<

3、br>　　定量蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代研究熱點(diǎn)之一,是疾病診斷的分子標(biāo)志物篩選和治療靶點(diǎn)鑒定的重要工具。二維電泳和穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白或肽段是定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的兩種技術(shù)。然而,由于蛋白質(zhì)組分極其復(fù)雜,不但包括同一基因的不同轉(zhuǎn)錄體、轉(zhuǎn)錄后不同的剪切體,還涉及翻譯后的修飾過(guò)程。到目前為止,沒(méi)有任何單一技術(shù)能夠徹底全面的分析任意物種的全部蛋白質(zhì)組組分,而且高豐度蛋白通常掩蓋了具有重要生理、病理功能的低豐度蛋白。亞蛋白質(zhì)組學(xué)能夠有效降低蛋白質(zhì)組

4、的復(fù)雜性,是挖掘低豐度蛋白生物標(biāo)志物常用策略之一,如細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞核等亞蛋白質(zhì)組、各功能復(fù)合體蛋白質(zhì)組、特異物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組等。
　　哺乳動(dòng)物中,蛋白質(zhì)糖基化修飾是最為常見(jiàn)的一種翻譯后修飾,糖蛋白約占所有蛋白的50%。糖蛋白的寡糖側(cè)鏈不但具有重要的生理功能,如蛋白質(zhì)分子細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白穩(wěn)定性、酶活性、粘附性、蛋白質(zhì)分子間及細(xì)胞間相互作用、識(shí)別等功能;而且亦參與許多病理過(guò)程,如蛋白質(zhì)的異常糖基化是腫瘤形成與進(jìn)展過(guò)程中的一

5、個(gè)基本特性,與癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。糖蛋白的功能日益顯著和重要,詳盡闡明糖蛋白質(zhì)組組分及功能有助于增進(jìn)理解認(rèn)識(shí)生理、病理過(guò)程。
　　根據(jù)寡糖側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基不同,可將糖蛋白分為N-連接糖蛋白(與天冬酰胺殘基酰胺氮相連)和O-連接糖蛋白(與絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸殘基的羥基共價(jià)結(jié)合)。N-糖基化位點(diǎn)是N-X-S/T組成的三聯(lián)序列子區(qū)域,其中的X可為脯氨酸以外的任意氨基酸。N-寡聚糖側(cè)鏈的變異發(fā)生于多種腫瘤,包括寡聚

6、糖核心結(jié)構(gòu)及末端殘基結(jié)構(gòu)的變化;該變異同時(shí)也導(dǎo)致同一蛋白形成不同糖蛋白異構(gòu)體,在二維凝膠電泳圖譜上表現(xiàn)為多個(gè)不同等電點(diǎn)或分子量相近的蛋白質(zhì)點(diǎn)。寡聚糖作為蛋白質(zhì)分子翻譯后修飾的主要成分之一,大大增加了蛋白質(zhì)分子的功能多樣性。在細(xì)胞外的微環(huán)境中,N-連接糖蛋白存在相當(dāng)普遍,如胞膜蛋白的胞外區(qū)域、分泌蛋白及血清、唾液、腦脊液等體液內(nèi)。上述證據(jù)表明糖蛋白變化反映了許多疾病的病理過(guò)程,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值,故而許多現(xiàn)在臨床應(yīng)用的診斷標(biāo)志物或治療

7、靶點(diǎn)多為糖蛋白,如CA125(卵巢癌)、PSA(前列腺癌)、c-erbB-2(乳腺癌)、AFP-L3和GP73(肝癌)等?？梢灶A(yù)見(jiàn),系統(tǒng)、定量分析糖蛋白的變化,不但有利于新的疾病診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及治療效果的評(píng)價(jià)與監(jiān)測(cè)手段的探尋,還有助于進(jìn)一步理解疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律及治療的分子機(jī)制。
　　方法：采用植物凝集素串聯(lián)法提取ESCC與癌旁切緣形態(tài)學(xué)正常食管黏膜組織中的N-連接糖蛋白,二維電泳和質(zhì)譜等分析、鑒定與ESCC發(fā)生展密切相關(guān)的

8、差異表達(dá)的糖蛋白質(zhì)分子,為ESCC的早期診斷和高危人群普查提供更多的候選分子,并為深入理解ESCC發(fā)病的分子機(jī)制奠定重要理論基礎(chǔ)。
　　1、根據(jù)標(biāo)本庫(kù)中ESCC患者的臨床資料,如年齡、性別、病理分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等,選取適宜手術(shù)標(biāo)本,NP-40裂解液提取各例ESCC及癌旁組織蛋白,Bradford法測(cè)定蛋白濃度,從各例ESCC標(biāo)本及癌旁組織蛋白提取物中,分別取等量蛋白制備混合樣本。
　　2、植物凝集素

9、親合層析柱的制備:寡甘露糖型親合層析柱,分別加入500ul的瓊脂糖偶聯(lián)刀豆凝集素(Concanavalin A, ConA)、晶狀體凝集素(Lentil lectin, LCH)、雪花凝集素(Sonwdrop lectin, GNA)于Poly-Prep層析柱內(nèi);唾液酸型蛋白層析柱,分別加入等量的瓊脂糖偶聯(lián)的麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA)、接骨木凝集素(Elderberry lectin, SNA)于

10、Poly-Prep層析柱內(nèi);然后用含有0.01%Triton X-100的糖蛋白結(jié)合緩沖液洗滌1次,再用糖蛋白結(jié)合緩沖液洗滌2次以備用。
　　3、N-連接糖蛋白序列性抽提:用N-連接糖蛋白結(jié)合緩沖液將6000ug的混合蛋白標(biāo)本稀釋至1ml,加入寡甘露糖蛋白親合層析柱,室溫孵育2h,500rpm收集流出液,結(jié)合緩沖液洗滌4次,各10min,用200mM的甲基-α-D甘露糖苷洗脫富含寡甘露糖的N-連接糖蛋白;混合上述的流出液及洗滌液,

11、加入唾液酸蛋白層析柱,如上洗滌后用200mM的N-乙酰葡糖胺洗脫富含唾液酸的N-連接糖蛋白。
　　4、二維電泳及質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異表達(dá)的糖蛋白質(zhì)分子:將上述洗脫液中加入-20℃丙酮使終濃度至80%,-20℃過(guò)夜,15,000g離心30min,棄上清,室溫干燥20min,加入100ul的2D裂解液溶解沉淀蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白濃度,取50μg的蛋白,加入2D裂解液至250ul,用13cm pH3-10 NL IPG膠條進(jìn)行一

12、維等電聚焦電泳;等電聚焦后分別用含1%DTT和2.5%IAA平衡液孵育15min,然后進(jìn)行第二維的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染、掃描、圖像分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,確定具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白點(diǎn)。制備質(zhì)譜分析的2D膠,蛋白的上樣量增加至1000ug,如上法進(jìn)行等電聚焦、二維電泳、考馬斯亮藍(lán)染色,切取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)、膠內(nèi)胰酶消化、MALDI-TOF-TOF檢測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定差異蛋白點(diǎn)的名稱。
　　5、關(guān)鍵候選糖蛋白質(zhì)分

13、子差異表達(dá)的驗(yàn)證:應(yīng)用Western blot,驗(yàn)證關(guān)鍵候選蛋白質(zhì)分子或具有異常N-連接糖基化的蛋白質(zhì)異構(gòu)化在ESCC中的差異表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、鑒定出36個(gè)ESCC相關(guān)的差異表達(dá)的寡甘露糖型糖蛋白,包括20個(gè)高表達(dá)寡甘露糖型糖蛋白和16個(gè)低表達(dá)寡甘露糖型糖蛋白;
　　2、鑒定出39個(gè)與ESCC相關(guān)的差異表達(dá)的唾液酸型糖蛋白,包括10個(gè)高表達(dá)唾液酸型糖蛋白和29個(gè)低表達(dá)糖蛋白;
　　3、Westen bl