應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選口腔扁平苔蘚唾液差異蛋白.pdf

1、目的:口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種常見(jiàn)的口腔黏膜疾病，病因不明，易反復(fù)發(fā)作，有一定的癌變傾向，被世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為癌前狀態(tài)。在我們前期研究中，應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出142個(gè)差異表達(dá)基因，而基因是通過(guò)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來(lái)進(jìn)行表達(dá)。隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，然而僅憑基因DNA序列及其表達(dá)仍不足以解決基因表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量甚至蛋白質(zhì)的翻譯后加工及修飾等情況，因此，這

2、些基因組學(xué)不能解決的問(wèn)題可以在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中找到答案。目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其研究越來(lái)越多地應(yīng)用到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，尤其是在研究疾病的病因及發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。以往采用雙向凝膠電泳技術(shù)研究扁平苔蘚差異蛋白的方法誤差較大，蛋白定量不準(zhǔn)確，而且蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)組織和血液研究較多，對(duì)唾液的研究較少。而唾液取材的簡(jiǎn)便、安全、低成本和無(wú)創(chuàng)性以及含有許多有助于疾病早期診斷的蛋白質(zhì)，使得唾液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展受到人們的關(guān)注，

3、但是由于唾液的蛋白質(zhì)種類較多，蛋白質(zhì)濃度相差較大，對(duì)于唾液蛋白的提取沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，還需要進(jìn)一步探索。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選、鑒定與口腔扁平苔蘚患者唾液有關(guān)的差異蛋白，以探討唾液中某些相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化與口腔扁平苔蘚發(fā)生的可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　1提取唾液蛋白預(yù)試驗(yàn)
　　分別采用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法及2-D Clean-Up Kit的方法提取新鮮唾液蛋白，并將苯酚

4、抽提復(fù)溶后的蛋白經(jīng)超聲處理50s，通過(guò)觀察十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶，確定提取唾液蛋白的最適方法。
　　2唾液蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
　　收集9例口腔扁平苔蘚患者及9例正常人唾液，為了減少個(gè)體差異對(duì)本研究的影響，分別將每組3例唾液混合，作為一個(gè)試驗(yàn)樣品。按照2-DClean-Up Kit說(shuō)明書操作提取唾液總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶觀察

5、唾液蛋白的提取情況。
　　3雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)、質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白
　　采用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，Typhoon9410掃描獲取電泳圖譜，DecyderTM2D6.5軟件尋找差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，將凝膠進(jìn)行Deeppurple染色，然后用Ettan Spot Picker將差異蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切下，胰酶酶解，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析，將生成的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Bio Wo

6、rks3.3.1數(shù)據(jù)分析軟件中的SEQUEST算法進(jìn)行計(jì)算，在NCBI中搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果:
　　1預(yù)試驗(yàn)結(jié)果
　　預(yù)試驗(yàn)應(yīng)用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法提取唾液蛋白，用DIGEbuffer復(fù)溶后均有粘稠透明膠狀物出現(xiàn)，且甲醇/NH4HCO3沉淀法提取蛋白后蛋白有明顯的丟失現(xiàn)象，將膠狀物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后出現(xiàn)蛋白條帶，說(shuō)明唾液蛋白復(fù)溶時(shí)并沒(méi)有完全溶解到DIGEbuffer

7、中，為了增加唾液蛋白的溶解度，將苯酚抽提蛋白復(fù)溶后經(jīng)超聲處理50s，測(cè)定蛋白濃度，盡管蛋白濃度有所上升，但仍有膠狀物存在，唾液蛋白并沒(méi)有完全溶解。而經(jīng)2-D Clean-Up Kit提取蛋白，DIGE buffer復(fù)溶蛋白后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膠狀物的存在，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示各樣品條帶清晰，無(wú)明顯蛋白質(zhì)丟失、降解。2-D Clean-UpKit適合唾液蛋白質(zhì)的提取。
　　2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

8、>　　口腔扁平苔蘚患者組和正常人組用2-D Clean-Up Kit提取唾液蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示蛋白條帶清晰，沒(méi)有明顯蛋白丟失和降解。
　　3雙向熒光差異凝膠電泳結(jié)果
　　雙向熒光差異凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，圖像重復(fù)性較好、分辨率較高，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量分布范圍較廣。DecyderTM2D6.5軟件分析扁平苔蘚患者組和正常人組唾液差異蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)平均為317±71個(gè)，并用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)鑒定了重復(fù)