間質(zhì)細(xì)胞源性因子-1受體拮抗劑AMD3100對顳葉癲癇異常神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控作用.pdf

1、癲癇是最常見而嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，已被世界衛(wèi)生組織列入全球重點防治的五大神經(jīng)精神疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國癲癇患病率高達(dá)7‰，我國現(xiàn)有900萬以上癲癇患者，而且還以每年新發(fā)40萬-60萬例的速度遞增。經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療，大多數(shù)病人的癲癇發(fā)作可得到控制，但仍有20-30％的病人癲癇難以控制，最終發(fā)展為難治性癲癇，其中60％-70％為顳葉癲癇。顳葉癲癇以自發(fā)的反復(fù)癇性發(fā)作，認(rèn)知障礙和抑郁為其特征，是最常見的難治性癲癇類型。海馬異常

2、的神經(jīng)發(fā)生是顳葉癲癇模型的一個顯著特征，包括苔蘚纖維芽生，顆粒細(xì)胞門區(qū)異位遷移，門區(qū)基底樹突，突觸重組等，這些病理變化被認(rèn)為對大腦異?；顒悠鸬酱龠M(jìn)作用。在顳葉癲癇的急性期齒狀回的神經(jīng)發(fā)生增強，而在慢性期神經(jīng)發(fā)生則明顯地減低。這可能與新生細(xì)胞在急性期和慢性期所處的微環(huán)境的改變有關(guān)。間質(zhì)細(xì)胞源性因子-1(Stromal cell-derived Factor1，SDF-1)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，在生理狀態(tài)下SDF-1與其特異

3、性受體CXCR4高度表達(dá)在側(cè)腦室下區(qū)及齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)這兩個腦內(nèi)主要的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域。近來有研究發(fā)現(xiàn)成年腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞也表達(dá)SDF-1/CXCR4。當(dāng)SDF-1與CXCR4受體結(jié)合后，與CXCR4相連的G蛋白被激活，并進(jìn)一步激活下游的信號傳導(dǎo)途徑，從而使細(xì)胞骨架發(fā)生改變，引起神經(jīng)干細(xì)胞遷移、黏附，并調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。在癲癇、中風(fēng)等形式的腦損傷后，主要由死亡或受損的神經(jīng)細(xì)胞、活化的膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞釋放的SDF-1通過與CX

4、CR4受體結(jié)合，能夠吸引神經(jīng)干細(xì)胞遷移到細(xì)胞變性、死亡區(qū)域及炎癥區(qū)域。如果能夠改變癲癇后新生神經(jīng)細(xì)胞所處的微環(huán)境，從而調(diào)控異常的神經(jīng)發(fā)生，可能會對癲癇尤其是難治性癲癇的治療起到更積極的作用。我們通過側(cè)腦室注射海人酸致顳葉癲癇模型觀察了CXCR4拮抗劑AMD3100對海馬異常神經(jīng)發(fā)生的影響。
　　實驗方法:
　　1、實驗動物的分組:采用雄性Wistar大鼠，體重200-250g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為6組:急

5、性期:(1)假手術(shù)組(n=5);(2)癲癇組(n=5);(3) AMD3100組(n=5)。慢性期:(1)假手術(shù)組(n=5);(2)癲癇組(n=5);(3) AMD3100組(n=5)。
　　2、顱內(nèi)注射KA制作顳葉癲癇模型:采用顱內(nèi)注射海人酸(kainic acid，KA)的方法制作顳葉癲癇模型。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜，用立體定位的方法將KA注射到大鼠側(cè)腦室制作模型。
　　3、微量滲透泵顱內(nèi)給藥:在造模后第1天或第61天，用立

6、體定位的方法在頸部皮下埋置灌注AMD3100的微量滲透泵，進(jìn)行側(cè)腦室內(nèi)持續(xù)給藥，連續(xù)7天。
　　4、5-嗅脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU)示蹤標(biāo)記:在造模后第8天或第72天，向腹腔內(nèi)注射BrdU100mg/kg標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，每天2次，間隔12小時，連續(xù)2天，最后一次注射后24小時取材。
　　5、組織切片的制備:以上各組動物分別于造模后第10天或第74天用多聚甲醛灌注固定，取腦，用恒冷切片機行連

7、續(xù)腦冠狀冰凍切片(片厚50μm)。
　　6、免疫熒光染色:用免疫熒光法觀測大鼠海馬齒狀回DCX、BrdU、DCX/BrdU陽性細(xì)胞并測定海馬門區(qū)異位遷移的顆粒細(xì)胞數(shù)及樹突發(fā)育情況。
　　7、共聚焦顯微鏡成像:在共聚焦顯微鏡下獲取海馬齒狀回區(qū)域DCX陽性細(xì)胞的Z軸方向系列圖層后，對新生神經(jīng)細(xì)胞樹突及軸突進(jìn)行三維重建，然后使用NIHImageJ軟件對樹突、軸突及其分支進(jìn)行追蹤描繪與測量，以觀察DCX陽性細(xì)胞的樹突發(fā)育成熟情況。<

8、br>　　8、行為學(xué)測試:應(yīng)用Morris水迷宮實驗對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行定量評價。
　　9、腦電圖記錄:在造模后第72天進(jìn)行腦電圖描計，觀察各組大鼠癇性發(fā)作頻率及平均持續(xù)時間。
　　10、統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0 for windows進(jìn)行。應(yīng)用單因素方差分析或重復(fù)測量方差分析來判斷差異的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　1、AMD3100對顳葉癲癇急性期

9、海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組明顯地增加(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　2、AMD3100對顳葉癲癇慢性期海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組減少(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/Brd

10、U陽性細(xì)胞數(shù)目較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　3、AMD3100對顳葉癲癇急性期新生神經(jīng)細(xì)胞異位遷移的影響。癲癇組海馬門區(qū)的DCX陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于假手術(shù)組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬門區(qū)DCX陽性細(xì)胞數(shù)較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　4、AMD3100對顳葉癲癇慢性期新生神經(jīng)細(xì)胞異位遷移的影響。癲癇組海馬門區(qū)的DCX陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于假手術(shù)組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬門區(qū)DCX

11、陽性細(xì)胞數(shù)較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　5、AMD3100對顳葉癲癇急性期齒狀回顆粒細(xì)胞樹突發(fā)育的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的項樹突及基底樹突長度顯著長于假手術(shù)組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的項樹突及基底樹突長度較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　6、AMD3100對顳葉癲癇慢性期齒狀回顆粒細(xì)胞樹突發(fā)育的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的頂樹突及基底樹突長度顯著長于假手術(shù)組

12、(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的頂樹突及基底樹突長度較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　7、AMD3100對顳葉癲癇慢性期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響與假手術(shù)組相比，癲癇組的逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)，而穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。AMD3100組與癲癇組相比，逃避潛伏期有所縮短，穿越平臺的次數(shù)增多，但兩組間差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　8、AMD3100對顳葉癲癇慢性

13、期大鼠癇樣放電的影響。癲癇組大鼠腦電圖可以記錄到持續(xù)存在散在發(fā)作的棘波。AMD3100組大鼠腦電圖棘波出現(xiàn)的頻率及每次出現(xiàn)持續(xù)的時間均明顯減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期與慢性期大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。
　　2、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期與慢性期新生神經(jīng)細(xì)胞向海馬門區(qū)的異位遷移。
　　3、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期和慢性期新生神經(jīng)細(xì)