神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Boyden小室體外侵襲模型的建立及CXCL12及其受體拮抗劑AMD3100對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤遷移和侵襲能力的影響.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Boyden小室體外侵襲模型的建立
　　 目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤之一，侵襲程度高，為了研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲特性，本實(shí)驗(yàn)室建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的原發(fā)瘤細(xì)胞系及神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者骨髓轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞系，為研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)特性提供一個(gè)良好模型。Boyden小室細(xì)胞培養(yǎng)模型具有綜合判斷腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，侵襲小室呈桶狀，底部裝有聚碳酸酯微孔濾膜，濾膜表面涂有人

2、工基底膜，侵襲小室和培養(yǎng)板共同構(gòu)成細(xì)胞侵襲的上、下室。待測(cè)細(xì)胞種于上室，下室則是吸引細(xì)胞向下遷移的趨化液。有侵襲力的細(xì)胞首先粘附于人工基底膜表面，進(jìn)而分泌基質(zhì)金屬蛋白酶消化降解人工基底膜，并通過遷移運(yùn)動(dòng)而穿過多孔濾膜，最后附著在濾膜另一面，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目可反映該細(xì)胞的侵襲力。為了探討Hoyden小室法應(yīng)用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的具體條件，我們檢測(cè)了四種不同的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系在不同細(xì)胞濃度和不同時(shí)間的侵襲細(xì)胞數(shù)，從中獲得穩(wěn)定的細(xì)胞濃度和

3、侵襲時(shí)間，作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤體外侵襲性模型的標(biāo)準(zhǔn)化條件。
　　 方法：將不同濃度(1.5x105,2.0x105,2.5x105,3.Ox105/ml1)的100ul四種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系置入Boyden小室侵襲模型上室，分別培養(yǎng)24,36,48,60h，觀察不同濃度的細(xì)胞在不同時(shí)間穿透基質(zhì)膠聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，用Boyden小室測(cè)定四種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系細(xì)胞侵襲的能力。
　　 結(jié)果：Boyden小室侵襲模型顯示四種不同細(xì)

4、胞系的侵襲能力不完全相同，在第24h透過ECM膠聚碳酸酷膜的細(xì)胞較少，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，在48h前后增幅最明顯;同時(shí)隨細(xì)胞濃度的增高，透過細(xì)胞數(shù)也增加，但細(xì)胞濃度大于2.5x105/ml時(shí)，透過ECM膠聚碳酸醋膜的細(xì)胞數(shù)變化不顯著;在同一條件下，有骨髓轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系其侵襲能力大于無骨髓轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Boyden小室體外侵襲模型，該模型對(duì)體外神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的測(cè)定

5、和研究及對(duì)探明神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和影響因素具有重要意義。
　　 第二部分、CXCL12及其受體拮抗劑AMD3100對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤遷移和侵襲能力的影響
　　 目的：侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的的重要特征，惡性腫瘤細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)移能力和趨向性，是腫瘤細(xì)胞成功發(fā)生轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶形成的主要決定因素。近年來的研究結(jié)果顯示，某些惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出定向的器官特異性。趨化因子在腫瘤嗜器官轉(zhuǎn)移中起了重要作用。趨化因子CXCL12與其特異性受

6、體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，神經(jīng)母細(xì)胞瘤首先轉(zhuǎn)移到骨髓，由于NB這種獨(dú)特的轉(zhuǎn)移規(guī)律和骨髓微環(huán)境中CXCL12的高含量以及CXCR4在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的普遍表達(dá)，因此我們推測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤是利用CXCR4介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，激活腫瘤細(xì)胞穿越血管及組織間質(zhì)而發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，從而形成NB的骨髓特異性轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Boyden小室研究不同濃度的CXCL12誘導(dǎo)國(guó)人有骨髓轉(zhuǎn)移

7、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移和侵襲;再用CXCL12特異性受體拮抗劑AMD3100阻斷該生物學(xué)軸，探討CXCL12/CXCR4生物軸在NB細(xì)胞系遷移和侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法：用不同濃度的CXCL12(30,100,300 ng/ml)誘導(dǎo)國(guó)人有骨髓轉(zhuǎn)移神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移、侵襲;同時(shí)觀察AMD3100對(duì)CXCL12誘導(dǎo)遷移、侵襲的干預(yù)作用。用Boyden小室法測(cè)定其遷移、侵襲能力，觀察不同濃度之間神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移、侵