ADAM10基因缺失對成年小鼠大腦Aβ肽的產(chǎn)生和認(rèn)知功能的影響.pdf

1、目的:淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶水解,釋放出Aβ肽。Aβ肽是淀粉斑的核心成分,它的過多生成或聚集被認(rèn)為是阿爾茨海默病致病的主要原因。APP蛋白還有另一條非淀粉樣蛋白加工途徑,在這條途徑中,它被α-分泌酶和γ-分泌酶連續(xù)水解。由于α-分泌酶的水解APP位點(diǎn)在Aβ肽內(nèi)部,因此,可以減少Aβ肽的生成。目前,已經(jīng)證實(shí)去整合素和金屬蛋白酶10(ADAM10)是神經(jīng)元的組成型APPα-分泌酶。但是,ADAM10缺失究竟對成年

2、神經(jīng)細(xì)胞的功能造成何種影響迄今不清楚,為此,我們利用本室建立的成年大腦神經(jīng)細(xì)胞特異性ADAM10基因敲除小鼠(ADAM10cKO)模型研究ADAM10基因缺失對APP代謝水平和小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。
　　方法:利用PCR方法鑒定ADAM10cKO小鼠的基因型。鑒定出的純合子小鼠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。按照常規(guī)的組織學(xué)方法,取3、6、9和12月齡ADAM10cKO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠(WT)的大腦,經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包

3、埋、切片和HE染色,觀察ADAM10cKO小鼠和WT小鼠大腦海馬和皮層組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),以及皮層第5層和海馬神經(jīng)元數(shù)量的變化。分別取7、9、11、12、13和15月齡ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl對照小鼠的大腦,經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片和免疫組織化學(xué)染色,觀察β淀粉樣蛋白(Aβ)在大腦皮層和海馬組織中的分布,并分析Aβ沉積與年齡的關(guān)系。分別提取20月齡的ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl小鼠的皮層和

4、海馬組織蛋白,采用Westernblotting方法定量測定APP和Aβ肽的含量,分析ADAM10基因缺失對APP代謝的影響。分別取10月齡ADAM10cKO小鼠和WT小鼠各9只進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),通過檢測逃避潛伏期、目標(biāo)象限(原先放置平臺的象限)停留的時(shí)間百分比和1min內(nèi)穿過平臺次數(shù)評價(jià)兩組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　結(jié)果:HE染色結(jié)果表明,3、6、9和12月齡ADAM10cKO小鼠大腦皮層和海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,但是,皮層

5、第Ⅴ層的神經(jīng)元數(shù)量隨著年齡的增大而減少,海馬神經(jīng)細(xì)胞減少更為明顯。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,7、9、11、13和15月齡ADAM10cKO小鼠與同齡的ADAM10Fl/Fl對照小鼠相比,其大腦皮層和海馬未見淀粉斑,但在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可溶性Aβ肽呈年齡依賴性增加。可溶性Aβ肽的含量在兩種小鼠的海馬和皮層的神經(jīng)細(xì)胞中表現(xiàn)出差異。Westernblotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ADAM10cKO小鼠與ADAM10FL/FL小鼠比較,其成熟與非成熟的全

6、長APP蛋白含量在海馬中分別減少73.0％和62.3%(P﹤0.01),但是,在大腦皮層中,成熟與非成熟的全長APP蛋白含量變化不明顯;ADAM10cKO小鼠大腦皮層和海馬中Aβ肽總含量分別增加20.45%和27.21%(P<0.05和P<0.01),皮層中Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42肽的含量分別增加32.85%、25.37%和80.95%(P<0.05,P<0.05和P<0.01),海馬中Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1

7、-42肽的含量分別增加41.67%、38.36%和22.22%(P﹤0.05),呈現(xiàn)明顯差異。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在訓(xùn)練期間,ADAM10cKO小鼠的平均潛伏期比WT小鼠的時(shí)間長,第2天和第3天分別表現(xiàn)出明顯差異(P﹤0.05和P﹤0.01)。在測試期間,ADAM10cKO小鼠和WT小鼠相比,其平均穿越平臺的次數(shù)少,并且,平均停留目標(biāo)象限時(shí)間的百分比低,均呈現(xiàn)明顯差異(P﹤0.05)。
　　結(jié)論:ADAM10基因缺失導(dǎo)致成年小鼠大