ADAM10在長骨發(fā)育障礙和骨肉瘤進展中的作用.pdf

1、不同類型細胞在骨骺區(qū)動態(tài)相互作用，通過軟骨內(nèi)骨化的方式促進長骨生長，骨骺區(qū)還是骨肉瘤好發(fā)部位。其中最常見的細胞類型為骨骺區(qū)一側(cè)的肥大軟骨細胞以及另一側(cè)的侵入破骨細胞、成骨細胞、及血管內(nèi)皮細胞。目前對于軟骨細胞、成骨細胞、及破骨細胞之間的相互調(diào)節(jié)在軟骨內(nèi)骨化中的作用了解較多，但對血管內(nèi)皮細胞在其中的作用了解甚少。我們此前發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞敲除ADAM10會導致小鼠長骨生長缺陷，但此生長缺陷的潛在原因并不清楚，此外對于細胞表面金屬蛋白酶ADAM1

2、0是否在骨肉瘤中起作用仍不明確。ADAM10是Notch信號的主要調(diào)節(jié)因子，內(nèi)皮細胞缺乏ADAM10(ADAM10ΔEC)小鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)顯示出特征性的血管分支增加，也是Notch信號缺陷所特有的現(xiàn)象。大多數(shù)ADAM10ΔEC小鼠可以存活數(shù)月，該動物模型因此提供了研究內(nèi)皮細胞缺乏ADAM10如何影響長骨生長的獨特機會。另一方面，近期研究表明Notch信號通路促進骨肉瘤的形成和腫瘤侵襲，提示作為Notch受體主要脫落酶的ADAM10在骨

3、肉瘤的進展中可能通過影響腫瘤血管生成起作用。本課題旨在比較ADAM10ΔEC小鼠和對照小鼠不同發(fā)育階段的長骨生長情況，重點研究骨骺區(qū)血管內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、及破骨細胞可能的形態(tài)及分布異常，此外還研究了ADAM10與骨肉瘤進展及血管生成的相關(guān)性。
　　第一部分:ADAM10在小鼠長骨發(fā)育障礙中的作用
　　材料與方法
　　1.內(nèi)皮細胞ADAM10敲除(ADAM10ΔEC)模型小鼠的建立及鑒定。通過將ADAM10lox/lo

4、x小鼠與表達內(nèi)皮細胞特異性Tie2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，建立ADAM10內(nèi)皮細胞敲除小鼠(ADAM10ΔEC，基因型為ADAM10lox/loxTie2-Cre+/-)及正常對照小鼠(Control，基因型為ADAM10lox/loxTie2-Cre-/-);提取小鼠尾部DNA，PCR法通過檢測loxP及Tie2產(chǎn)物鑒定小鼠型別(ADAM10ΔEC小鼠或?qū)φ招∈?。
　　2.ADAM10ΔEC小鼠長骨發(fā)育缺陷的動態(tài)改變。采用Fa

5、xitronX射線儀監(jiān)測ADAM10ΔEC/對照小鼠不同發(fā)育時間點多種長骨發(fā)育缺陷的動態(tài)變化，并計算松質(zhì)骨密度改變;茜素紅-阿辛藍大體骨-軟骨染色確定敲除ADAM10對長骨的骨及軟骨的大體影響;小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片HE染色、番紅精-固綠軟骨染色，確定股骨及脛骨生長板區(qū)軟骨代謝及軟骨細胞改變，并計算內(nèi)皮細胞敲除ADAM10后對生長板內(nèi)軟骨細胞增生的影響。
　　3.內(nèi)皮細胞敲除ADAM10對小鼠長骨骨骺區(qū)血管發(fā)育的影響。利用小鼠內(nèi)皮細

6、胞特異性endomucin抗體行膝關(guān)節(jié)骨組織切片免疫熒光染色，對比檢測內(nèi)皮細胞敲除ADAM10后對股骨骨骺區(qū)血管形態(tài)的改變;通過甲基丙烯酸酯血管鑄型構(gòu)建股骨骨骺區(qū)血管三維模型，研究內(nèi)皮細胞敲除ADAM10對小鼠長骨骨骺區(qū)血管發(fā)育的三維改變。
　　4.ADAM10在小鼠內(nèi)皮細胞缺失后對骨骺區(qū)破骨細胞的影響及與血管異常的聯(lián)系。小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片TRAP染色，確定內(nèi)皮細胞缺失ADAM10后骨骺區(qū)破骨細胞數(shù)目的改變;endomucin-

7、TRAP雙重染色，研究ADAM10內(nèi)皮細胞敲除后血管發(fā)育異常與破骨細胞改變的相關(guān)性。
　　5.敲除小鼠內(nèi)皮細胞ADAM10對破骨細胞分化的影響。分離ADAM10ΔEC/對照小鼠股骨及脛骨骨髓細胞，體外用巨噬細胞-擊落刺激因子(M-CSF)分化培養(yǎng)為巨噬細胞，加入/不加入RANKL繼續(xù)分化為破骨細胞，TRAP染色確定破骨細胞數(shù)目及形態(tài)改變。
　　6.小鼠內(nèi)皮細胞敲除ADAM10對骨骺區(qū)RANKL/OPG信號通路的影響。分離AD

8、AM10ΔEC/對照小鼠上下肢骨骺區(qū)軟骨并提取RNA，實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(realtimequantitativeRT-PCR)mRNA水平檢測RANKL/OPG比值改變，以確定RANKL/OPG信號通路對ADAM10內(nèi)皮細胞敲除引起的破骨細胞改變的影響。
　　結(jié)果
　　1.ADAM10內(nèi)皮細胞敲除導致小鼠多個長骨發(fā)育障礙。FaxitronX線攝片長度測量分析顯示，小鼠內(nèi)皮細胞缺失ADAM10導致股骨及脛骨最早于生后7天明

9、顯短縮(P7)，其中股骨短縮隨時間進展明顯加重，肱骨、尺骨、橈骨于生后14天開始明顯短縮，而上肢掌骨在所有監(jiān)測時間點(P7-P183)均無明顯短縮;骨密度分析顯示ADAM10ΔEC小鼠股骨及脛骨生長板下骨松質(zhì)密度均顯著增高，分別始于P28及P21。
　　2.ADAM10敲除導致長骨生長板結(jié)構(gòu)異常。小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片HE染色顯示，與對照小鼠相比ADAM10ΔEC小鼠股骨生長板生后7天及14天未見明顯異常，生長板后方在生后21天則開

10、始出現(xiàn)不連續(xù)，至生后28天生長板后方進展為局部中斷，而生長板前方肥大軟骨細胞層則表現(xiàn)為不規(guī)則增厚，此外HE染色還顯示骨松質(zhì)密度增加導致ADAM10ΔEC小鼠股骨髓腔較對照小鼠明顯變窄，生后42天出現(xiàn)整個生長板區(qū)多個部位顯著中斷;ADAM10ΔEC小鼠脛骨生長板于生后14天開始出現(xiàn)不同于股骨生長板改變的中央型肥大軟骨細胞層明顯增厚，一直持續(xù)至監(jiān)測到的生后42天，并導致生長板下骨缺損。番紅精-固綠軟骨染色顯示生后21天ADAM10ΔEC小鼠

11、股骨及脛骨生長板增生軟骨細胞層開始出現(xiàn)軟骨合成減少。茜素紅-阿辛藍全組織染色顯示ADAM10ΔEC小鼠生后42天股骨遠端骨骺線出現(xiàn)早閉。
　　3.小鼠內(nèi)皮細胞中缺失ADAM10導致骨骺區(qū)血管發(fā)育紊亂。免疫熒光染色顯示ADAM10ΔEC小鼠股骨骨骺區(qū)于生后14天出現(xiàn)endomucin熒光抗體顯著增強，分析顯示骨骺區(qū)血管密度顯著增加，生后21天生長板中斷處證實有血管侵入，至28天生長板被貫穿處上下側(cè)均發(fā)現(xiàn)有血管侵入，脛骨骨骺區(qū)則出現(xiàn)襻

12、樣血管團，或于增厚的生長板下方出現(xiàn)血管缺失;相較ADAM10ΔEC小鼠而言，對照小鼠骨骺區(qū)血管分布規(guī)則、均勻，且endomucin熒光染色較淺;甲基丙烯酸酯血管鑄型解剖顯微鏡下顯示對照小鼠股骨血管為單個大的中央動脈延伸至骨骺區(qū)分支為逐漸增多的規(guī)則、平行、細小的血管環(huán)，而ADAM10ΔEC小鼠股骨血管鑄型則顯示骨骺區(qū)血管分布雜亂、交錯，以及多處小的血管球樣擴張。
　　4.ADAM10ΔEC小鼠長骨發(fā)育障礙由骨骺區(qū)破骨細胞數(shù)目明顯減少

13、引起。TRAP染色顯示在ADAM10ΔEC小鼠股骨骨骺區(qū)，生后7天及14天破骨細胞數(shù)目及分布較對照小鼠無明顯改變，生后21天破骨細胞數(shù)目開始出現(xiàn)顯著減少直至28天，脛骨骨骺區(qū)破骨細胞變化與股骨類似。
　　5.ADAM10內(nèi)皮細胞缺失引起的骨骺區(qū)破骨細胞數(shù)目減少與血管發(fā)育紊亂密切相關(guān)。Endomucin-TRAP雙重染色顯示，生后14天及28天股骨骨骺區(qū)TRAP+破骨細胞與endomucin+內(nèi)皮細胞在空間位置上緊密聯(lián)系，14天血管

14、密度明顯增加而破骨細胞數(shù)目未見明顯減少;28天同樣可見相似的血管密度增加，但股骨骨骺區(qū)破骨細胞數(shù)目則顯著減少。
　　6.內(nèi)皮細胞缺失ADAM10導致小鼠體外破骨細胞分化能力下降，但RANKL/OPG信號通路未受影響。體外破骨細胞細胞分化實驗表明ADAM10ΔEC小鼠來源于股骨及脛骨的骨髓細胞破骨細胞生成較對照小鼠稍延遲，導致TRAP+破骨細胞數(shù)目出現(xiàn)少量但統(tǒng)計學顯著的減少，而來源于小鼠上下肢骨骺區(qū)組織的定量PCR結(jié)果顯示ADAM1

15、0ΔEC小鼠與對照小鼠RANKL/OPG比值無顯著性差異。
　　第二部分:ADAM10在骨肉瘤進展中的作用
　　材料與方法
　　1.骨肉瘤樣本。主要樣本來源于購買的組織芯片，每張包含40例人骨肉瘤組織塊（多聚甲醛處理，石蠟包埋）病理分期從ⅠA至ⅡB期，組織類型包括:骨母細胞型骨肉瘤、軟骨母細胞型骨肉瘤、纖維母細胞型骨肉瘤、以及富含巨細胞骨肉瘤;部分石蠟包埋組織來源于本院病理科。
　　2.常規(guī)HE染色。確定腫瘤組織

16、來源、形態(tài)、及病理類型。
　　3.免疫熒光染色?？笴D31、抗胞內(nèi)ADAM10、抗胞內(nèi)段/活化Notch1(Notch1intracellulardomain，NICD)，DAPI(胞核染色)，免疫熒光染色骨肉瘤組織切片，并計算CD31、NICD表達強度，血管分支數(shù)目及ADAM10陽性細胞數(shù)目與腫瘤分期及組織類型的相關(guān)性;雙重免疫熒光染色(CD31/ADAM10，CD31/NICD)研究ADAM10/Notch1表達與腫瘤血管內(nèi)皮

17、細胞之間的關(guān)系。
　　4.TRAP染色。確定破骨細胞在骨肉瘤組織中的表達情況，并明確富含巨細胞骨肉瘤中的破骨細胞樣多核巨細胞是否為破骨細胞。
　　結(jié)果
　　1.ADAM10在腫瘤細胞中的表達與骨肉瘤的進展呈正相關(guān)。在所有骨肉瘤分期及病例中均發(fā)現(xiàn)有ADAM10局部聚集表達于骨肉瘤細胞中，隨著骨肉瘤從ⅠA期進展為ⅡB期，ADAM10+腫瘤細胞數(shù)目也顯著增加，ⅡA和ⅡB期的ADAM10+腫瘤細胞數(shù)目平均值較ⅠA期顯著升高;此

18、外骨母細胞型骨肉瘤中ADAM10+腫瘤細胞也顯著多于軟骨母細胞型骨肉瘤及纖維母細胞型骨肉瘤。
　　2.ⅠA/ⅠB期骨肉瘤存在一類血管原性腫瘤細胞，可能通過“胞質(zhì)內(nèi)陷”方式形成血管管腔。HE染色發(fā)現(xiàn)ⅠA/ⅠB期骨肉瘤中存在一類嗜堿性圓形腫瘤細胞，CD31染色呈陽性，證明其為血管原性，其中部分腫瘤細胞出現(xiàn)不同階段的“胞質(zhì)內(nèi)陷”，可能為形成血管管腔的一種機制，同時ADAM10也均一表達于這類細胞胞質(zhì)中。
　　3.富含巨細胞骨肉瘤中

19、的破骨細胞樣多核巨細胞并非破骨細胞，而是血管原性腫瘤細胞，涉及ADAM10/Notch1信號活化。TRAP/DAPI雙重染色證明富含巨細胞骨肉瘤中的多核巨細胞TRAP染色陰性，而骨母細胞型骨肉瘤、軟骨母細胞型骨肉瘤及纖維母細胞型骨肉瘤中均含TRAP+腫瘤細胞。CD31以中度水平均一表達于巨細胞胞質(zhì)中，ADAM10和活化的Notch1也共同表達于巨細胞中，其表達模式與CD31類似。
　　4.部分骨肉瘤血管結(jié)構(gòu)內(nèi)皮缺失。CD31染色發(fā)

20、現(xiàn)ⅠA期-ⅡB期部分骨肉瘤血管結(jié)構(gòu)中紅細胞未被血管內(nèi)皮包繞，但血管內(nèi)皮CD31染色陽性，證明其中并非由于血管內(nèi)皮不表達CD31而是因為血管內(nèi)皮缺失造成，其形成可能與多核巨細胞相關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.生長板區(qū)血管在調(diào)節(jié)破骨細胞僅在諸如股骨、肱骨、脛骨、尺骨、以及橈骨這些較大長骨的發(fā)育后期顯現(xiàn)出作用。
　　2.內(nèi)皮細胞中ADAM10對于長骨中特化的血管在軟骨內(nèi)骨化中的正常發(fā)育及功能是必需的。
　　3.ADAM10Δ

21、EC小鼠長骨骨骺區(qū)破骨細胞數(shù)目的減少很有可能是由ADAM10缺乏導致Notch信號異常，引起血管內(nèi)皮細胞分化障礙，導致血管結(jié)構(gòu)異常造成的，而不是由ADAM10缺乏導致血管內(nèi)皮釋放RANKL等可溶性因子缺陷造成的。
　　4.ADAM10在腫瘤細胞中的表達與骨肉瘤進展正相關(guān)。
　　5.ⅠA/ⅠB期骨肉瘤中存在一類血管原性腫瘤細胞，可能通過“胞質(zhì)內(nèi)陷”形成血管管腔，ADAM10參與其中。
　　6.富含巨細胞骨肉瘤中破骨細胞樣