急性B淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病個(gè)體化檢測(cè)的初步研究.pdf

1、目的：
　　急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)是淋巴干/祖細(xì)胞喪失分化能力而停滯于某一階段并無限增殖所致的惡性克隆性疾病。隨著白血病化療水平的提高、靶向藥物問世和造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展，白血病的長期生存有了明顯提高，然而仍有近50％患者會(huì)復(fù)發(fā)，主要原因是體內(nèi)仍殘留白血病細(xì)胞，稱為微小殘留病(MRD)。因此微小殘留病(MRD)成為研究熱點(diǎn)以及治愈白血病關(guān)鍵。目前檢測(cè)MRD主要有流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原以及更為敏感的PCR方法。由于大多數(shù)

2、ALL缺乏特異性強(qiáng)、且適合于所有患者的融合基因，并且?guī)缀跛蠥LL均存在的特異性的、個(gè)體化的免疫球蛋白輕、重鏈或T細(xì)胞受體基因重排，這種特異性的基因重排就成了PCR方法檢測(cè)MRD的主要靶點(diǎn)。目前國際上成功應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)MRD用于指導(dǎo)ALL臨床治療，并指出MRD水平的變化有助于區(qū)分高、低危ALL，并進(jìn)行分層治療，取得很好療效。國內(nèi)僅上海、蘇州等個(gè)別醫(yī)院開展了此項(xiàng)技術(shù)，東北地區(qū)醫(yī)院尚未開展此項(xiàng)技術(shù)，因此本研究通過歐洲BIOMED-2檢測(cè)系統(tǒng)

3、，采用多重PCR技術(shù)、Touch down PCR、克隆、DNA測(cè)序等技術(shù)，檢測(cè)B細(xì)胞ALL患者白血病細(xì)胞免疫球蛋白基因克隆性重排，設(shè)計(jì)針對(duì)每一個(gè)個(gè)體的特異性引物并在白血病初診階段以及緩解時(shí)期實(shí)施白血病細(xì)胞的監(jiān)測(cè)，將有效指導(dǎo)病人的個(gè)體化治療。
　　方法：
　　1、研究對(duì)象
　　在取得患者知情同意后，選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科經(jīng)過流式細(xì)胞儀確定的B系淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓11例，3例女性，8例男性，最大年齡53歲

4、，最小年齡30歲，中位數(shù)年齡39歲。
　　2、DNA提取
　　采用凍存的骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）標(biāo)本約5×106/L，用DNA提取試劑盒按操作說明從標(biāo)本中提取DNA，溶于30μl無核酸水中，-20度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　3、PCR擴(kuò)增
　　應(yīng)用歐洲BIOMED-2引物系統(tǒng)對(duì)11例DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并且優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系，采用了Touch down

5、 PCR技術(shù)，提高了檢測(cè)的靈敏度。
　　4、克隆
　　擴(kuò)增出的VH1-7基因約80-400 bp，其中＜150bp產(chǎn)物切膠純化后插入克隆載體pMDTM18-T Simple Vector，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5a，挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA，并將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙脫氧終止法測(cè)序。
　　5、序列分析
　　應(yīng)用congress軟件對(duì)序列進(jìn)行鏈接，并與PMD18基因序列進(jìn)行比對(duì)，找到PMD18的A尾、T

6、尾，篩選鏈接的目的基因進(jìn)行BLAST搜索。目的基因與14q32、2P11.2相吻合。
　　6、設(shè)計(jì)引物
　　獲取特異性重排序列與生殖細(xì)胞DNA序列比對(duì)，確定重組DNA序列，然后設(shè)計(jì)特異性引物。
　　結(jié)果：
　　1、獲取了8例ALL-MRD患者的IgH基因重排序列，4例患者IgK重排序列。
　　2、設(shè)計(jì)為1例IgH基因重排陽性患者設(shè)計(jì)特異性引物，成功擴(kuò)增出目的基因。
　　結(jié)論：
　　一、首次對(duì)我國