上轉(zhuǎn)換納米顆粒介導(dǎo)的光動(dòng)力療法修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]觀察在體外共培養(yǎng)并且接受980nm近紅外線(xiàn)照射后，上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs-PEG-M540)對(duì)幼年Sprague Dawley(SD)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的殺傷作用。探討UCNPs介導(dǎo)的光動(dòng)力療法在促進(jìn)大鼠脊髓損傷后減少損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕的形成和行為功能恢復(fù)方面所起的作用。
　　[方法]采用溶劑熱法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(NaYF4∶Yb3＋，Er3＋/NaYF4，UCNPs)，并用鍵聯(lián)的方法在顆粒表面包裹聚乙二

2、醇(Polyethylene glycol，PEG)和部花青M540（Merocyanine540）。顆粒(NaYF4∶Yb3＋，Er3＋/NaYF4-PEG-M540，UCNPs-PEG-M540)在體外被波長(zhǎng)980nm的近紅外線(xiàn)激光照射后，用二苯基異苯并呋喃(Diphenylisobenzo furan，DPBF)檢測(cè)是否有單線(xiàn)態(tài)氧(singletoxygen，1O2)的產(chǎn)生。取實(shí)驗(yàn)用幼年SD鼠2只，麻醉后取出脊髓組織并剪碎，置入裝

3、有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用差速黏附和恒溫?fù)u床震搖法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。細(xì)胞在體外增殖，傳代后，對(duì)其用GFAP免疫組化染色進(jìn)行鑒定，并觀察生長(zhǎng)狀況。傳至第2代后，將星形膠質(zhì)細(xì)胞收集并與顆粒共培養(yǎng)24小時(shí)，用波長(zhǎng)980nm的近紅外線(xiàn)激光照射后，MTT觀察細(xì)胞存活情況。并用電鏡觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化。與此同時(shí)，用NYU Impactor-Ⅱ打擊器制作Sprague Dawley大鼠胸10脊髓損傷模型(打擊重量和高度為:10g×50mm)。將8

4、0只脊髓損傷大鼠隨機(jī)分成4組:DMEM移植組;M540移植組;UCNPs-PEG移植組;UCNPs-PEG-M540移植組。大鼠脊髓損傷1周后，將上述4種移植物分別移植到4組大鼠脊髓損傷區(qū)周?chē)Ｐg(shù)后采用BBB評(píng)分對(duì)大鼠的行為功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。12周后，從每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行10％BDA順行示蹤標(biāo)記。標(biāo)記兩周后處死動(dòng)物，將損傷段脊髓取出作5μm快速冰凍切片后，進(jìn)行BDA顯影，GFAP和NF200免疫組化染色。Western blo

5、t定量分析GFAP在脊髓損傷區(qū)的表達(dá)。圖片用image pro plus5.0和ImageJ軟件處理，根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)的積分光密度值(IOD)進(jìn)行組間比較。
　　[結(jié)果]透射電子顯微鏡(TEM)顯示制備出的顆粒裸核NaYF4∶Yb3+，Er3+基本呈六角狀，且粒徑比較均勻，通過(guò)粒度分析儀檢測(cè)，結(jié)果顯示顆粒直徑在28nm左右。包殼后納米顆粒的形狀仍為六角狀，納米晶的平均尺寸為43nm。X-射線(xiàn)衍射(XRD)分析顯示，包殼后納米顆粒的衍射

6、圖譜與包殼前幾乎一致。裸核及核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒XRD圖均與標(biāo)準(zhǔn)的六角相納米顆粒NaYF4的衍射譜衍射峰的峰位吻合的很好，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所制備出來(lái)的裸核顆粒及核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒均是純的六角相的納米顆粒。傅立葉紅外光譜證明在顆粒NaYF4∶Yb3+，Er3+/NaYF4的表面成功的包覆上了PEG。能量色散X射線(xiàn)光譜分析(Energy Dispersive X-Ray spectrometry，EDX)證明M540被成功的連接到顆粒表面。DPBF在

7、410nm處的吸光度明顯減低，說(shuō)明經(jīng)近紅外線(xiàn)激發(fā)后，UCNPs-PEG-M540使周?chē)娜芤褐挟a(chǎn)生了單態(tài)氧。從幼鼠脊髓分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)純化后可以在體外穩(wěn)定的傳4代以上，純度為94.78％，形態(tài)類(lèi)似成纖維細(xì)胞，GFAP染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞倍增時(shí)間約為2-3天。細(xì)胞與顆粒共培養(yǎng)，并經(jīng)980nm近紅外光照射后，MTT顯示細(xì)胞存活率明顯下降。電鏡觀察顯示顆粒被細(xì)胞攝取，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞核發(fā)生碎裂、溶解現(xiàn)象，線(xiàn)粒體溶解，核漿比例失調(diào)。細(xì)胞呈現(xiàn)凋

8、亡或者壞死表現(xiàn)。將4種移植物分別移植到大鼠脊髓損傷區(qū)周?chē)?周開(kāi)始，UCNPs-PEG-M540移植組動(dòng)物的BBB評(píng)分顯著高于其余3組(p＜0.05)。BDA順行示蹤標(biāo)記顯示UCNPs-PEG-M540移植組較其余三組有較多的再生神經(jīng)纖維通過(guò)損傷區(qū)。在橫斷面上，UCNPs-PEG-M540移植組陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域的IOD值顯著高于其余三組(p＜0.05)。NF200染色結(jié)果表明，UCNPs-PEG-M540移植組陽(yáng)性反應(yīng)面積的IOD值顯著高于

9、其余三組(p＜0.05)。而GFAP染色結(jié)果表明，UCNPs-PEG-M540移植組陽(yáng)性反應(yīng)面積的IOD值顯著低于其余三組(p＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，GFAP的灰度值在UCNP-PEG-M540移植組的脊髓損傷區(qū)周?chē)钌伲‵值=2.17，P＜0.01），說(shuō)明膠質(zhì)瘢痕的形成在UCNP-PEG-M540移植組最少。
　　[結(jié)論]在980nm近紅外光的激發(fā)下，上轉(zhuǎn)換納米顆粒UCNPs-PEG-M540可以有效的殺