自聚合肽納米纖維材料介導(dǎo)siRNA干擾RhoA表達(dá)促進(jìn)小鼠脊髓損傷修復(fù).pdf

1、本研究旨在為組織工程治療神經(jīng)損傷、疾病探索新的治療策略——自聚合納米纖維材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold,SAPNS)介導(dǎo)RNA干擾(RNA interference,RNAi)RhoA表達(dá)促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。
　　 目前治療脊髓損傷的方法很多,外周神經(jīng)移植、細(xì)胞移植、生物材料填充損傷腔以及消除抑制因子等。這些研究在一定程度上都促進(jìn)了脊髓損傷的修復(fù)。然而,外周神經(jīng)移植需要

2、考慮神經(jīng)來源、細(xì)胞移植也有其來源及倫理道德方面的局限、消除抑制因子不徹底、以及治療策略的單一性、難以針對脊髓損傷修復(fù)困難的諸多不利因素等,都成為脊髓損傷修復(fù)的瓶頸。
　　 因此,尋求新型生物材料和探索新的方法避免以上問題,從而為臨床運(yùn)用提供更具可行性的策略,成為脊髓損傷修復(fù)的研究熱點(diǎn)。近年來,各種新方法和新型生物材料不斷涌現(xiàn)。
　　 SAPNS是近年來由美國麻省理工學(xué)院Zhang S課題組發(fā)明的一新型納米材料,目前已經(jīng)證

3、明它在多種組織修復(fù)中能發(fā)揮良好的效果,被認(rèn)為是組織損傷修復(fù)中最具應(yīng)用前景的組織工程修復(fù)材料之一。其在組織損傷修復(fù)的運(yùn)用中相比其他生物材料具有以下優(yōu)勢:不會引起明顯的免疫排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、其納米纖維直徑非常接近細(xì)胞外基質(zhì),能為細(xì)胞存活與遷移提供三維環(huán)境,能將攜帶生物致病源和污染的風(fēng)險降到最低,具有極好的組織相容性,無細(xì)胞毒性,降低產(chǎn)物可被組織吸收利用。
　　 研究表明RhoA在脊髓損傷修復(fù)中具有重要的作用。RhoA是屬于Rho家

4、族的一種小分子GTPase,它是所有真核細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動蛋白的調(diào)節(jié)因子。RhoA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段對神經(jīng)元遷移和突起的生長發(fā)揮重要作用,但在成年神經(jīng)元中基本不表達(dá)。當(dāng)神經(jīng)元受損后8h,RhoA表達(dá)又開始增高,損傷后3d可達(dá)到高峰,并可持續(xù)高表達(dá)2w以上。RhoA在神經(jīng)元損傷后重新高表達(dá)是中樞神經(jīng)再生困難的一個重要因?yàn)椤?br>　　 目前已知的抑制神經(jīng)再生的大部分相關(guān)因子都是通過激活下游的RhoA信號通路來發(fā)揮作用的。脊髓損傷后RhoA

5、表達(dá)的增高可導(dǎo)致軸突生長錐塌陷以及受損神經(jīng)元凋亡,這些都是導(dǎo)致脊髓損傷后再生困難的主要因?yàn)?。因?設(shè)法降低RhoA的表達(dá)或抑制其信號通路有可能成為促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的一個新的治療策略。
　　 RNA干擾是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù),它可利用 siRNA,-shRNA或miRNA感染靶細(xì)胞以降低特定基因的表達(dá)。目前,已有不少關(guān)于導(dǎo)入 siRNA進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾的報(bào)道。其中對中樞神經(jīng)組織進(jìn)行RNA干擾的方法主要有

6、2種:即靜脈注射和局部微量注射。然而靜脈注射用藥量大難以避免全身副作用,局部微量注射可對神經(jīng)組織造成不必要的二次損傷。所以有必要探索更加確實(shí)可行的用藥方法。
　　 本研究在脊髓損傷模型的基礎(chǔ)上,在損傷處移植含有 RhoA特異性 siRNA(RhoA—siRNA)和 SAPNS的復(fù)合材料,針對脊髓修復(fù)難點(diǎn)的多種復(fù)雜因素,以期在修復(fù)脊髓損傷處的同時減低RhoA的表達(dá),從而探索促進(jìn)脊髓損傷后結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)的新方法。
　　 本研

7、究分三個部分。
　　 第一部分:移植材料構(gòu)建以及脊髓損傷模型建立和移植。
　　 昆明小鼠,雌性,65只,12周齡,30-35g;動物分組和每組數(shù):假手術(shù)組(sham)10只,生理鹽水組(saline)15只,SAPNS組17只,siRNA+SAPNS組23只。
　　 無菌下取0.50DRhoA特異性干擾 RNA(RhoA-siRNA)或熒光標(biāo)記 siRNA(FAM-siRNA),用6μl DEPC水溶解。取2μl

8、siRNA溶液,2μlLipofect2000以及10μlSAPNS,于干凈的培養(yǎng)皿中迅速混合,后置于0.1M PBS溶液中4℃下孵育30min,使材料充分聚合。昆明小鼠麻醉后在小鼠 T7-9位置打開椎板,暴露脊髓,剪開硬脊膜后在T8位置垂直切除長度為1mm的一段脊髓。在形成的損傷腔內(nèi)填充上述構(gòu)建的移植材料或等量的生理鹽水。
　　 第二部分:siRNA轉(zhuǎn)染效率和RhoA表達(dá)的檢測。
　　 siRNA轉(zhuǎn)染效率檢測:移植入

9、FAM-siRNA+SAPNS的小鼠在手術(shù)后2d,1w,2w取材,取材部位脊懿為 T6-11,腦為皮質(zhì)運(yùn)動區(qū)。后做冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照,記錄siRNA進(jìn)入脊髓和大腦皮質(zhì)運(yùn)動區(qū)神經(jīng)元的情況。結(jié)果顯示,siRNA被脊髓神經(jīng)元軸突攝取,并且順利進(jìn)入大腦運(yùn)動皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體。
　　 RhoA表達(dá)的檢測:手術(shù)后1w各組任取5只小鼠,取材切片。行RhoA免疫組織化學(xué)染色,檢測RhoA表達(dá)。在熒光顯微鏡下觀察損傷區(qū)及其附近神經(jīng)元

10、內(nèi)RhoA表達(dá)情況,并拍照記錄。結(jié)果顯示,在RhoA-siRNA+SAPNS組中,RhoA表達(dá)顯著降低。
　　 第三部分:脊髓修復(fù)效果評定,行為學(xué)檢測和軸突再生定量分析。
　　 對實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料軸突密度數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(One-Way ANOVA)后用 LSD法作兩兩之間比較；BMS評分值用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)法多組間比較,組間兩兩比較用 Mann-Whitney

11、U檢驗(yàn)。
　　 后肢功能評定:手術(shù)后10w對所有剩下小鼠進(jìn)行后肢運(yùn)動功能BMS評定。軟件結(jié)果顯示,RhoA-siRNA+SAPNS組小鼠功能恢復(fù)好于損傷組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 軸突再生定量分析:術(shù)后10w取材切片,行軸突特異性標(biāo)志蛋白NF200免疫組織化學(xué)染色,拍照,每只動物記錄5張切片,使用圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus；Media Cybernetics,Silver Spring,Marylan