甲?；氖荏w和Ⅱ型膠原活化NSCs和BMSCs促進脊髓損傷修復(fù)的體外研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱外科的嚴重疾病之一，年輕人發(fā)病多由于車禍等暴力損傷，而老年人發(fā)病多由于退變的頸椎間盤突出壓迫。損傷后常出現(xiàn)截癱、下肢神經(jīng)功能障礙甚至死亡。由于脊髓自身的神經(jīng)細胞再生能力有限，SCI發(fā)生后各種治療效果都顯得十分蒼白。椎間盤內(nèi)髓核組織主要由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原構(gòu)成。和神經(jīng)細胞一樣，軟骨細胞也存在自身增殖能力有限的缺點。椎間盤在變性后幾乎無法修復(fù)，從而失去力學(xué)支撐，突出在

2、椎管內(nèi)對脊髓產(chǎn)生壓迫。目前以手術(shù)減壓為代表的治療方法無論因暴力還是椎間盤突出所導(dǎo)致的脊髓壓迫都只能提供間接的治療，無法達到滿意的恢復(fù)效果。因此干細胞移植成為一種用于治療SCI的新手段。神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)具有增殖、遷移以及分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和（或）少突膠質(zhì)細胞等功能，作為SCI后細胞移植治療用的主要載體。而骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)

3、定向分化為軟骨組織和細胞的能力，使其成為對椎間盤變性以及軟骨缺損的細胞移植治療用的主要載體。但在細胞移植后，干細胞的增殖、分化、遷移等轉(zhuǎn)歸問題還有很多因素無法確定，成為束縛細胞移植治療效果的瓶頸所在。本文在體外通過甲?；氖荏w(formylpeptide receptors，F(xiàn)prs)和Ⅱ型膠原的作用下研究對SCI相關(guān)干細胞即NSCs和BMSCs的增殖、分化、遷移的影響，為SCI相關(guān)干細胞移植治療提供基礎(chǔ)理論支持。
　　第一部分:

4、Fprs對NSCs的增殖、遷移和分化的作用
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理狀態(tài)下，NSCs可以遠距離的遷移到損傷部位，發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)，對損傷起到了一定的修復(fù)作用，但是NSCs如何遷移、到達局部后如何定向分化為功能性神經(jīng)元，其機制仍不明了。炎癥細胞易于通過趨化因子受體而遷移，NSCs是否也通過趨化因子受體而遷移？Fprs屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要在天然免疫和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，是經(jīng)典的趨化相關(guān)受體，主要表達于單核和中性粒細胞

5、上，也表達于肝臟等其他組織，近來被發(fā)現(xiàn)同樣表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦組織和脊髓組織中。但Fprs和NSCs之間是否有關(guān)聯(lián)目前尚未見報道。
　　我們根據(jù)文獻回顧的結(jié)果，設(shè)想Fprs和NSCs有關(guān)聯(lián)，并通過免疫熒光、蛋白印跡等方法檢測出NSCs能夠表達Fpr1和Fpr2。根據(jù)Fprs表達于NSCs的結(jié)果，通過Fprs的激動劑和阻斷劑檢測其對NSCs的功能和發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Fprs可以促進NSCs向神經(jīng)元方向分化，并且能夠促進NSCs

6、的遷移。本研究可加深Fpr1和Fpr2對內(nèi)源性NSCs的遷移和分化作用的認識，為細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦缺血和SCI開啟了一個全新的窗口。
　　目的:
　　探討甲?；氖荏w在體外對大鼠神經(jīng)干細胞的增殖、分化及遷移的作用。
　　方法:
　　體外提取并培養(yǎng)原代NSCs，對其性狀進行鑒定。分不同干預(yù)組(Fpr1激動劑和阻斷劑、Fpr2激動劑和阻斷劑)和空白對照組，分別作用于NSCs3d后，采用CCK-8法檢測各

7、組對NSCs活性的影響;免疫熒光法檢測不同組處理NSCs后，各組與空白對照組相比，DCX、GFAP、Olig2蛋白表達量的差異;蛋白印跡(Western Blotting，WB)法檢測不同組處理NSCs后，各組與空白對照組相比，DCX蛋白表達量的差異;形態(tài)學(xué)觀察和transwell法檢測，不同組處理NSCs后，各組與空白對照組相比，細胞遷移數(shù)量的差異。
　　結(jié)果:
　　(1)通過免疫熒光和WB法驗證了Fpr1和Fpr2存在于

8、NSCs上;(2)通過免疫熒光和WB法驗證了Fpr1和Fpr2的激動劑（fMLF和MMK-1）可促進NSCs向神經(jīng)元方向分化;(3)通過形態(tài)學(xué)觀察和transwell法驗證了Fpr1和Fpr2的激動劑（fMLF和MMK-1）可促進NSCs的遷移;(4)通過CCK-8法驗證了Fpr1和Fpr2對NSCs的增殖無影響。
　　第二部分:Ⅱ型膠原對BMSCs分化為軟骨細胞的作用
　　椎間盤變性突出的主要原因是軟骨細胞的變性和細胞外基

9、質(zhì)的水分丟失，隨著年齡的增長，發(fā)病率隨之增加。由于解剖結(jié)構(gòu)的局限，軟骨細胞缺乏直接的血運循環(huán)，損傷后自身修復(fù)或再生的能力非常有限。近年來越來越多的組織工程技術(shù)利用BMSCs的定向分化為軟骨組織和細胞的能力，并以此構(gòu)建為軟骨組織和細胞用于對軟骨缺損的治療已在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面都取得了極大的進展。但如何能夠讓其定向分化為軟骨細胞并且發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)在現(xiàn)目前的研究中還是個熱點和難點。Ⅱ型膠原(CollagenⅡ，colⅡ)可由軟骨細胞

10、分泌合成，具有親和性強，能為軟骨細胞的生長、增殖、分化及功能發(fā)揮近似于體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細胞外基質(zhì)作用的特點。研究表明Ⅱ型膠原在體內(nèi)和體外均可促進BMSCs向骨細胞方向分化，并可促進骨缺損的愈合，但其作為軟骨的細胞外基質(zhì)對BMSCs向軟骨細胞方向分化的研究少有報道，本實驗以Ⅱ型膠原作為細胞外基質(zhì)，體外研究Ⅱ型膠原對BMSCs向軟骨細胞方向的分化作用，了解Ⅱ型膠原對BMSCs分化為軟骨細胞的影響，以期Ⅱ型膠原作為仿生材料，用于損傷后軟骨的

11、修復(fù)研究提供實驗依據(jù)。
　　目的:
　　探討Ⅱ型膠原在體外促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的定向分化作用。
　　方法:
　　體外原代提取并培養(yǎng)BMSCs，對其性狀進行鑒定。分不同colⅡ接種濃度組(25、50、100、200μg/ml)和空白對照組，分別作用于BMSCs7、14、21 d，采用CCK-8法檢測各不同濃度組和時間點對BMSCs活性的影響;qPCR法檢測不同濃度組處理BMSCs后，各濃度組與空白對照

12、組相比，CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan mRNA表達量的差異，免疫熒光法檢測不同濃度組處理BMSCs后，各濃度組與空白對照組相比，CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan蛋白表達量的差異。
　　結(jié)果:
　　(1) CCK-8檢測結(jié)果顯示各濃度組在7、14、21 dD(450)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義;(2) qPCR檢測方法顯示21 d后，不同濃度組與空白對照組比較，CollagenⅡ、SOX9及Aggrec

13、an mRNA表達量均升高(p＜0.05)，以100μ g/ml組最高(p＜0.01);14 d時，各濃度組CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan mRNA以100μg/ml組上調(diào)最明顯(p＜0.05)，而在7d時，各組之間三者mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);(3)各濃度組21天時免疫熒光結(jié)果顯示:在100μg/ml組CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan蛋白的表達量較其他各組均明顯上調(diào)(p＜0.05)。

14、
　　綜上所述:本文通過免疫熒光法、WB法首次證實了Fpr1和Fpr2在NSCs上表達，并發(fā)現(xiàn)Fpr1和Fpr2的激動劑可以促進NSCs的遷移以及向神經(jīng)元方向的分化，而這種作用又可被其阻斷劑所抑制。表明Fprs表達于NSCs上，并且在NSCs的遷移及分化中起到了重要的作用。通過不同濃度組colⅡ干預(yù)BMSCs21d后，軟骨細胞標志物（SOX9、Aggrecan及CollagenⅡ）mRNA水平和蛋白水平在100μg/ml組增高最明