改性膠原支架組織工程化脊髓修復(fù)成年鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后的神經(jīng)再生一直是生物醫(yī)學(xué)界研究的一個重要課題。近年來的基礎(chǔ)研究表明脊髓損傷后仍存在一定再生能力，一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，然而成年哺乳動物脊髓損傷后的修復(fù)仍十分困難。組織工程為脊髓損傷的研究提供了一條新的修復(fù)途徑，其三大支柱是“理想的種子細(xì)胞+合適的支架材料+細(xì)胞因子”，其中支架材料必須具有以下性能：(1)良好的細(xì)胞和組織生物相容性；(2)細(xì)胞能在材料表面良好粘附和增殖；(3)

2、材料能夠誘導(dǎo)細(xì)胞按預(yù)制形態(tài)生長；(4)可控的生物降解吸收性，在新組織長成后，材料能夠在體內(nèi)降解成對人體無毒的小分子，并通過代謝排出體外；(5)具有高孔隙度的三維立體結(jié)構(gòu)；(6)具有可塑性和適宜的力學(xué)性能。 目前構(gòu)建脊髓組織工程的支架材料按來源可分為兩大類，即天然生物材料和人工合成材料。天然生物材料最大優(yōu)點(diǎn)是可降解、生物相容性好，降解產(chǎn)物易于被吸收而不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，但是存在力學(xué)性能差，降解性能不易調(diào)控。人工合成材料中可降解性高分子

3、材料降解速度和強(qiáng)度易調(diào)節(jié)，容易塑型和構(gòu)建高孔隙度三維支架，但該類生物材料的缺點(diǎn)在于降解產(chǎn)物會對細(xì)胞的產(chǎn)生不利影響。 天然生物材料中膠原來源廣泛，具有良好生物相容性和特殊的生物可降解性，降解產(chǎn)物氨基酸可以被機(jī)體完全吸收，是最早被應(yīng)用的天然生物材料。已經(jīng)有研究表明膠原具有特異性的分子識別信號，可促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，可為細(xì)胞生長提供支架。然而，由于膠原力學(xué)強(qiáng)度和降解速率的限制，使其難以單獨(dú)作為組織工程中的支架材料來進(jìn)

4、行組織器官的體外構(gòu)建。因此對膠原材料進(jìn)行改性，在保持其良好的生物相容性基礎(chǔ)上有效提高其力學(xué)性能并降低其降解速度，是膠原材料在組織工程中得以廣泛應(yīng)用的前提。 本實(shí)驗(yàn)擬體外構(gòu)建天然支架材料膠原并對其進(jìn)行交聯(lián)改性，并通過支架材料的性能測試和生物相容性研究與人工合成材料PGA，PLGA進(jìn)行比較。然后選擇脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞接種在篩選出來的支架材料上，再以胚胎脊髓懸浮液(Fetalspinal cord extracts，F(xiàn)SC

5、E)提供NSC生長分化所需的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)，以期構(gòu)建組織工程化脊髓用于移植修復(fù)成年大鼠脊髓損傷。 目的：選擇合適的支架材料，利用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程化脊髓，研究其在修復(fù)成年大鼠脊髓損傷中的作用。 方法：1.神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。分離和克隆擴(kuò)增孕14天SD大鼠胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞，行Nestin免疫熒光染色鑒定；制備FSCE并將其加入到在體外培養(yǎng)的NSC中，并在第3、7天進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定，以觀察其對N

6、SC的誘導(dǎo)分化作用。對照組以10％的胎牛血清進(jìn)行誘導(dǎo)分化。2．組織工程支架材料的選擇。制備鼠尾源性膠原海綿支架，并分別通過化學(xué)交聯(lián)(EDC交聯(lián))和物理交聯(lián)(DHT交聯(lián))對支架進(jìn)行交聯(lián)改性；構(gòu)建PGA和PLGA支架；通過力學(xué)性能測試，孔隙率測定，降解率測定及生物相容性實(shí)驗(yàn)和電鏡掃描來比較上述5種支架材料，并選擇出最為合適的支架材料。3．組織工程化脊髓的體外構(gòu)建。將神經(jīng)干細(xì)胞種植在篩選出來的支架中，以胚胎脊髓提取液對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化72小時，

7、通過HE染色、免疫熒光組織化學(xué)檢測和掃描電鏡觀察，了解其組織結(jié)構(gòu)。4．組織工程化脊髓移植修復(fù)成年鼠急性脊髓損傷。制作脊髓半橫斷損傷動物模型，A組植入組織工程化脊髓，B組植入神經(jīng)干細(xì)胞+支架，c組植入支架材料，D組無移植物。術(shù)后3周和8周進(jìn)行HE染色和免疫熒光組織化學(xué)檢查觀察種子細(xì)胞的存活和分化情況，并利用改良標(biāo)準(zhǔn)BBB評分和SEP檢查評估動物的運(yùn)動和感覺功能，了解組織工程化脊髓修復(fù)脊髓損傷的效果。 結(jié)果： 1．原代和傳代

8、細(xì)胞均表達(dá)NSC的特有標(biāo)志物Nestin，NSC生長有3個明顯的分期，即生長緩慢期、對數(shù)生長期和平臺期。FSCE誘導(dǎo)分化3天和7天后，分別有16.37％和18.14％神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，明顯高于對照組的6.77％和7.69％，二者之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。 2．EDC交聯(lián)的膠原生物相容性與膠原和DHT交聯(lián)的膠原相比無明顯差異，明顯優(yōu)于PGA和PLAG。EDC交聯(lián)的膠原力學(xué)性能優(yōu)于膠原和DHT交聯(lián)的膠原，并顯著

9、降低了膠原的體外降解率。 3．體外構(gòu)建的組織工程化脊髓含有NF200陽性細(xì)胞，GFAP陽性細(xì)胞及MBP陽性細(xì)胞。各種細(xì)胞成分均勻散布在三維網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)中并不斷分化發(fā)育成熟，新生的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出的軸突相互交錯，形成較規(guī)則的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。 4．術(shù)后第2周開始到第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，A組和B組的功能評分明顯高于C組和D組的動物，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.01)。A組與B組相比，功能恢復(fù)更為明顯(P<0.05)。術(shù)后第2周開

10、始直至第6周，A組和B組動物的BBB評分恢復(fù)均比較迅速。6周以后進(jìn)入平臺期。術(shù)后6周，A組SEP的P<,1>,N<,1>波潛伏期較正常組顯著延長(p<0.01)，但明顯短于B組(p<0.05)，C組和D組(p<0.01)。術(shù)后3周和8周的組織學(xué)結(jié)果表明，A組移植物中大量標(biāo)記細(xì)胞存活，細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯多于B組(P<0.01)。Brdu標(biāo)記的細(xì)胞中，A組有較多NF200陽性細(xì)胞出現(xiàn)，GFAP陽性細(xì)胞在術(shù)后8周形成了規(guī)則的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。而在B組，也有

11、一定數(shù)量的NF200陽性細(xì)胞，GFAP細(xì)胞形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)缺乏規(guī)則，較A組雜亂。C組界面區(qū)也無膠質(zhì)瘢痕過度增生，D組的脊髓缺損區(qū)被瘢痕組織填充。 結(jié)論： 1．胚胎脊髓提取液支持神經(jīng)干細(xì)胞成活并有效的誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 2．采用EDC交聯(lián)制備的膠原海綿保持了膠原固有的良好的生物相容性，同時在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中塌陷不明顯，仍保持其形狀和多孔性，體外試驗(yàn)表明改性膠原降解速度顯著減慢，有利于作為脊

12、髓組織工程中的支架材料。 3．以改性膠原為支架材料，神經(jīng)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，并以胚胎脊髓提取液提供細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)建的組織工程化脊髓，在體外可進(jìn)一步成熟并分化，其內(nèi)包含有神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等成分，有獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)。 4．以改性膠原為支架的組織工程化脊髓移植至成年鼠體內(nèi)后，其種子細(xì)胞存活并進(jìn)一步分化，形成功能相活躍的神經(jīng)元，分化的膠質(zhì)細(xì)胞形成了較為規(guī)則的的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。改性膠原為支架的組織工程化脊髓對成年