二甲雙胍對SW872細(xì)胞增殖、分化、凋亡及肥胖兒童血漿脂源性激素影響的研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和人們物質(zhì)生活水平的不斷提高，兒童青少年肥胖癥(obesity)發(fā)病率在全球迅速增長。肥胖不僅對兒童心理造成一定的影響，同時，由肥胖所引起的常見于成人的疾病如胰島素抵抗(Insulinresistance，IR)、2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)、高脂血癥(hyperlipoidemia)等，在兒童中的發(fā)病率也日益增多。兒童期肥胖也是成人期肥胖的重要危險因素之一，大約30％-60％

2、的兒童期肥胖可持續(xù)到成年期。因此，肥胖不僅是青少年正面臨的一個重要問題，也是將來成年后所要面臨的重要健康問題。 肥胖是體脂的過多積聚，是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加和體積的增大，是脂肪細(xì)胞增殖、分化及凋亡失衡的結(jié)果。二甲雙胍(metformin)為雙胍類降糖藥，是唯一獲得美國FDA批準(zhǔn)用于治療兒童青少年2型糖尿病、肥胖的口服降糖藥。大量的臨床研究結(jié)果表明，二甲雙胍在改善胰島素抵抗、降低血糖的同時，還具有減輕肥胖患者體重的作用，但其確切機(jī)制

3、目前尚不清楚。此外，有研究表明，二甲雙胍可以抑制原代培養(yǎng)人脂肪細(xì)胞纖溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1)的表達(dá)，并通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路抑制體外培養(yǎng)的小鼠脂肪細(xì)胞瘦素(1eptin)的分泌。 本研究以人源性的前脂肪細(xì)胞—SW872細(xì)胞為研究對象，觀察二甲雙胍對SW872細(xì)胞增殖、分化

4、及凋亡的影響，并予二甲雙胍干預(yù)治療高胰島素血癥(hyperinsulinism)肥胖兒童，觀察治療前后患兒體重指數(shù)(BodyMassIndex，BMI)、糖代謝指標(biāo)及血漿脂源性激素的變化，以期探明二甲雙胍減輕肥胖兒童體重的可能機(jī)制，為二甲雙胍廣泛用于兒童肥胖癥的治療提供理論依據(jù)。 第一部分 SW872細(xì)胞增殖與油酸誘導(dǎo)其分化的研究 目的：了解SW872細(xì)胞的體外增殖情況，探討油酸對SW872細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，為

5、體外研究脂肪細(xì)胞功能及其相關(guān)疾病建立細(xì)胞模型。 方法：應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)法了解SW872細(xì)胞的體外增殖情況，光學(xué)顯微鏡觀察SW872細(xì)胞的形態(tài)變化，油紅O染色觀察胞漿中脂滴的聚集，化學(xué)比色法測定細(xì)胞中甘油三脂的總量。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)的SW872細(xì)胞生長曲線呈“S”形，倍增時間為65.48±2.99小時。2.油酸誘導(dǎo)分化24h時，SW872細(xì)胞胞體由小變大，形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，胞漿中出現(xiàn)細(xì)小的脂滴；誘導(dǎo)分化48h時，細(xì)胞體積

6、進(jìn)一步變大，幾乎所有細(xì)胞形態(tài)變圓，胞漿中脂滴明顯增多；誘導(dǎo)分化72h時，細(xì)胞呈戒環(huán)狀，胞漿脂滴含量更多，油紅O染色胞漿中可見豐富的脂肪染色。3.0.6mM油酸誘導(dǎo)分化24h時，細(xì)胞中甘油三脂含量增多，是分化前的5.2倍(P＜0.01)；誘導(dǎo)分化48h時，甘油三脂含量是分化前的9.1倍(P＜0.01)；誘導(dǎo)分化72h時，甘油三脂含量是分化前的14.8倍(p＜0.01)。 結(jié)論：SW872細(xì)胞的體外增殖符合貼附生長型前脂肪細(xì)胞的生長

7、規(guī)律，油酸刺激72h，能成功誘導(dǎo)SW872細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。 第二部分 二甲雙胍對SW872細(xì)胞增殖及分化影響的研究 目的：觀察二甲雙胍對SW872細(xì)胞增殖及分化的影響，探索二甲雙胍治療肥胖的可能機(jī)制。 方法：細(xì)胞計數(shù)法觀察二甲雙胍對SW872細(xì)胞生長曲線和倍增時間的影響，MTT法檢測SW872細(xì)胞增殖活力，油紅O染色觀察胞漿中脂滴的聚集，化學(xué)比色法測定細(xì)胞中甘油三脂含量的變化，RT-PCR方法檢

8、測SW872細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-α的mRNA水平。 結(jié)果：1.二甲雙胍對SW872細(xì)胞生長曲線、倍增時間和增殖活力無影響。2.0.01mM二甲雙胍作用72h，使SW872細(xì)胞甘油三酯含量下降3.2％，與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲雙胍分別使SW872細(xì)胞甘油三酯含量下降21.5％、46.6％、48.6％，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)；油紅O染色顯示

9、胞漿中脂滴逐漸減少。3.0.01mM二甲雙胍作用72h，使SW872細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γmRNA的表達(dá)下降4.9％，與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.1mM、0.5mM和1.0mM二甲雙胍分別使PPAR-γmRNA的表達(dá)下降24.4％、47.8％和51.1％，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。4.0.01mM二甲雙胍作用72h，使SW872細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-αmRNA的表達(dá)下降6.7％，與對照組相

10、比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲雙胍則分別使SW872細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-αmRNA的表達(dá)下降31.3％、45.4％、52.1％，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論：二甲雙胍對SW872細(xì)胞的體外增殖無影響，但呈劑量依賴性地抑制SW872細(xì)胞的分化。 第三部分 二甲雙胍對SW872細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究 目的：觀察二甲雙胍對SW872細(xì)胞凋

11、亡的影響，探索二甲雙胍治療肥胖的可能機(jī)制。 方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對SW872細(xì)胞凋亡的影響，RT-PCR方法檢測SW872細(xì)胞Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)的改變。 結(jié)果：1.SW872細(xì)胞的自然凋亡率為(3.54±0.28)％，0.01mM二甲雙胍作用48h，SW872細(xì)胞的凋亡率是自然凋亡率的1.5倍，與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲雙胍分別作用48h，SW8

12、72細(xì)胞的凋亡率分別是自然凋亡率的4.7倍、8.7倍和9.5倍，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。2.0.5mM二甲雙胍作用12h，SW872細(xì)胞的凋亡率是自然凋亡率的2.9倍，與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.5mM二甲雙胍分別作用24h、36h和48h，SW872細(xì)胞的凋亡率分別是自然凋亡率的4.6倍、6.5倍和8.9倍，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。3.0.01mM二甲雙胍作用48h，SW872細(xì)

13、胞Bcl-2mRNA表達(dá)下降10.3％，與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；而0.1mM、0.5mM、1.0mM二甲雙胍分別作用48h，SW872細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)分別下降29.9％、54.0％、58.6％，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。4.0.5mM二甲雙胍作用12h、24h、36h和48h，SW872細(xì)胞Bcl-2mRNA的表達(dá)分別下降18.0％、31.5％、42.7％、55.1％，與對照組相比差異有顯著性

14、(P＜0.01)。5.二甲雙胍對SW872細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)無影響(P＞0.05)。 結(jié)論：二甲雙胍通過降低SW872細(xì)胞Bcl-2mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)SW872細(xì)胞的凋亡。 第四部分 高胰島素血癥肥胖兒童血漿脂源性激素的變化及二甲雙胍干預(yù)效果 目的：了解高胰島素血癥肥胖兒童血漿脂源性激素IL-6、脂聯(lián)素(Adiponectin)及瘦素(Leptin)的變化，并予二甲雙胍干預(yù)治療，觀察治療前后脂

15、源性激素的改變，為臨床用藥提供參考。 方法：研究對象共76例，年齡5～17歲，男48例，女28例，其中高胰島素血癥肥胖兒童44例，正常對照兒童32例。單純性肥胖癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：體重超過同性別、同身高正常小兒標(biāo)準(zhǔn)體重的20％，并排除遺傳、內(nèi)分泌性疾病等引起的繼發(fā)性肥胖。高胰島素血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹胰島素(FINS)＞25mIU/L或空腹胰島素(FINS，μIU/mL)/空腹血糖(FPG，mg/dL)＞0.3診斷為高胰島素血癥。采用ELI

16、SA法檢測血漿IL-6、脂聯(lián)素(Adiponectin)及瘦素(Leptin)水平；葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FPG)濃度，電化學(xué)發(fā)光法測定空腹胰島素(FINS)濃度。 結(jié)果：1.高胰島素血癥肥胖兒童BMI、FINS、IL-6、瘦素均高于健康對照組兒童，而脂聯(lián)素低于健康對照組，差異有顯著性(P＜0.05)；同時，高胰島素血癥肥胖兒童與健康對照組兒童血漿FPG濃度無顯著性差異(P＞0.05)；2.予二甲雙胍治療4-6個月后，高胰

17、島素血癥肥胖兒童BMI下降了20.6％，空腹胰島素下降了40.7％，差異有顯著性(P＜0.05)，而治療前后空腹血糖無明顯變化(P＞0.05)；3.二甲雙胍治療4-6個月后，高胰島素血癥肥胖兒童血漿IL-6、瘦素的濃度分別下降了36.0％和37.6％，差異有顯著性意義(P＜0.05)，而脂聯(lián)素的濃度則無明顯改善(P＞0.05)。 結(jié)論：高胰島素血癥肥胖兒童血漿脂源性激素IL-6及瘦素(Leptin)明顯升高，而脂聯(lián)素(Adipo