TRAIL與LDM聯(lián)用和作用機制及TRAIL蛋白的表達.pdf

1、第一部分力達霉素聯(lián)合TRAIL對人非小細胞肺癌的協(xié)同作用及其相關機制研究
　　 背景與目的：研究烯二炔類抗腫瘤抗生素力達霉素(LDM)與腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)聯(lián)合作用對人非小細胞肺癌H460細胞的增效作用及其作用機制。
　　 方法：采用MTT法觀察LDM和/或TRAIL聯(lián)合用藥對非小細胞肺癌細胞系H460細胞增殖的抑制作用。利用Annexin V-FITC/PI雙染、流式細胞術和Hoechst333

2、42熒光染色方法檢測兩藥聯(lián)合對細胞凋亡的影響。采用Western blot檢測在不同濃度LDM作用條件下TRAIL受體DR4、DR5的表達情況和凋亡通路中PARP、Caspase3和Caspase8分子的變化。
　　 結果：LDM和TRAIL均能夠抑制人非小細胞肺癌H460細胞的增殖，MTT結果顯示，兩藥聯(lián)合抑制效果增強，其CDI＜1，具有協(xié)同作用。LDM與TRAIL單獨用藥IC50值分別為4.60×10-10mol/L和915

3、ng/mL，LDM與TRAIL兩者聯(lián)合后作用效果增強，在50ng/mL、100ng/mL TRAIL濃度下LDM的IC50值分別為3.06×10.11mol/L和1.61×10-11mol/L。熒光顯微鏡下觀察在50ng/mL TRAIL或1×10-10mol/L LDM作用8h下H460細胞少量凋亡，而兩者聯(lián)合作用下絕大部分H460細胞均已凋亡。兩藥單獨作用以及聯(lián)合作用于H460細胞12小時后，1×10-10mol/LLDM作用組的細

4、胞凋亡率為26.1％,50ng/mL TRAIL作用組的細胞凋亡率為62.3%，聯(lián)合作用組的細胞凋亡率為74.7%，顯著高于對照組。與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組中caspase-3和caspase-8的活性明顯增強，因此，聯(lián)合用藥組中H460細胞的凋亡率也明顯增加。Western blot結果顯示LDM能夠增強TRAIL受體DR5的表達，不僅有劑量依賴性，且時間越長，表達量越高。而LDM在時間和濃度上對TRAIL受體DR4的表達卻幾乎沒

5、有影響。
　　 結論：LDM對人非小細胞肺癌H460細胞具有生長抑制作用，并能夠通過誘導DR5表達而促進TRAIL引起的腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖，增加細胞對TRAIL的敏感性。
　　 第二部分TRAIL蛋白的構建表達及生物學活性研究
　　 背景與目的：本研究的目的是從人胎盤組織中獲取TRAIL基因，并在大腸桿菌中大量表達，分離純化后對其相關生物學活性進行檢測。
　　 方法：采用兩步法RT-PCR從胎盤組

6、織中獲取TRAIL基因，采用PCR擴增和DNA克隆技術獲得sTRAIL序列，并在3’端插入組氨酸標簽編碼序列。將該重組基因經過雙酶切后插入到pET30a(+)表達載體中，得到重組表達載體。將表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)starTM中，加入0.2mmol/L IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。裂解菌體后可得到包涵體，包涵體變性后采用Ni2+親和層析法分離純化得到目的蛋白，Western Blot對純

7、化出的融合蛋白進行鑒定。產物采用ELISA檢測了其與受體的結合活性。
　　 結果：經過RT-PCR得到了TRAIL基因，將其插入到表達載體后成功實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達。產物主要以包涵體的形式存在于大腸桿菌中，Ni2+親和層析對其進行分離純化，得到的目的蛋白量為每升發(fā)酵液得到3mg活性蛋白。Western blot證實了純化的蛋白為帶有His-tag標簽的目的蛋白。ELISA結果顯示蛋白對人非小細胞肺癌H460細胞有很強的結合活