復(fù)方TRAIL脂質(zhì)體的抗腫瘤作用研究.pdf

1、TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)的通用名為重組人凋亡素2配體(Recombinant human Apo-2 ligand，Apo2-L)，分子量約為19493道爾頓。與其他腫瘤壞死因子或化療藥物相比，TRAIL可快速啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，強(qiáng)力、廣譜誘導(dǎo)腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織細(xì)胞基本無(wú)影響，具有良好的臨床意義和應(yīng)用前景。然而，很多腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL并不敏感，這一現(xiàn)象嚴(yán)重

2、限制了TRAIL的臨床應(yīng)用。近期的研究表明，某些化療藥物可顯著增強(qiáng)TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，具有協(xié)同抗腫瘤作用。因此，TRAIL與化療藥物合用已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
　　目前，TRAIL與化療藥物合用已在臨床上取得了初步進(jìn)展，但其在治療上仍存在以下缺陷:①TRAIL半衰期較短（人體的T1/2＜0.6 h），為維持其有效血藥濃度，用藥頻繁且給藥劑量大，而大劑量TRAIL具有發(fā)熱，乏力，白細(xì)胞降低及中性粒細(xì)胞降低等毒副作用;②

3、TRAIL和化療藥物組織分布廣泛，對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)專屬的靶向治療作用;③由于腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥特性，TRAIL與化療藥物合用的療效仍然有限，至今尚未取得令人矚目的進(jìn)展。利用納米遞藥系統(tǒng)克服上述缺陷是治療腫瘤的一種新思路。本研究擬利用長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包載TRAIL和化療藥物（阿霉素和放線菌素D）制備復(fù)方脂質(zhì)體。該遞藥系統(tǒng)既可以延長(zhǎng)兩種藥物的體內(nèi)滯留時(shí)間，又可利用EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤部位，促使脂質(zhì)體在腫瘤部位釋放藥物，提高復(fù)方用藥的抗腫瘤效果。因此，

4、本課題具有較好的研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
　　本文第一章制備了復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體并對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以pH梯度法制各了阿霉素脂質(zhì)體，其粒徑和包封率分別為98.4±19.2 nm和96.2±3.6％。因TRAIL為蛋白類藥物，故在制備TRAIL脂質(zhì)體前考察了超聲、凍融和溫度對(duì)其活性的影響。結(jié)果表明超聲和溫度(＜50℃)對(duì)TRAIL的活性無(wú)顯著影響，凍融對(duì)TRAIL的活性有嚴(yán)重的破壞作用。在此基礎(chǔ)上，利用薄膜分散

5、法制備了TRAIL脂質(zhì)體，其粒徑和包封率分別為115.6±25.4 nm和10.4±3.9％。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87具有更強(qiáng)的殺傷作用，對(duì)正常細(xì)胞BCEC（小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）的抑制作用無(wú)顯著增加，表明復(fù)方脂質(zhì)體可能具有更好的安全性和更高的治療指數(shù)。
　　本文第二章以活體成像技術(shù)對(duì)復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體的腫瘤靶向特性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明包載近紅外熒光探針

6、Dir的脂質(zhì)體對(duì)肺癌皮下瘤和原位腦膠質(zhì)瘤均具有一定的腫瘤靶向特性。與Dir溶液相比，Dir脂質(zhì)體不但增加了腫瘤部位的蓄積，而且降低了其在肝和脾的濃集，顯示脂質(zhì)體作為藥物載體具有良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。以阿霉素為研究對(duì)象，以荷A-549細(xì)胞皮下瘤裸小鼠為模型，考察了阿霉素脂質(zhì)體的組織分布學(xué)特性。結(jié)果表明，與阿霉素溶液相比，阿霉素脂質(zhì)體在心臟的分布顯著降低，在腫瘤的濃度顯著增加，表明阿霉素脂質(zhì)體可以降低心肌毒性，增加抗腫瘤效果。重要的是，阿霉素脂質(zhì)

7、體與TRAIL脂質(zhì)體復(fù)方后對(duì)其組織分布特性無(wú)顯著性影響，表明復(fù)方脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后可能將兩種藥物同時(shí)輸送至腫瘤部位釋放，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。
　　本文第三章對(duì)復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體的體內(nèi)抗腫瘤療效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以荷A-549細(xì)胞皮下瘤裸小鼠為模型，復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體能夠顯著抑制皮下瘤的生長(zhǎng),且1.5 mg/kg和3 mg/kg阿霉素脂質(zhì)體與TRAIL脂質(zhì)體復(fù)方的抑瘤率與5 mg/kg阿霉素脂質(zhì)體相當(dāng)?？乖荒X膠質(zhì)瘤的藥

8、效學(xué)評(píng)價(jià)表明，復(fù)方脂質(zhì)體組的中位生存期比生理鹽水組延長(zhǎng)了50％，而單用脂質(zhì)體或溶液劑延長(zhǎng)的中位生存期均低于25％。上述結(jié)果表明復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體在體內(nèi)具有較強(qiáng)的協(xié)同增效作用，提示復(fù)方脂質(zhì)體可有效提高抗腫瘤效果，降低化療藥物的毒副作用，具有良好的臨床意義和應(yīng)用前景。
　　第四章以A-549和U87細(xì)胞為模型，考察了復(fù)方TRAIL—阿霉素脂質(zhì)體協(xié)同增效的機(jī)理。研究顯示復(fù)方脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞內(nèi)死亡受體、caspase家族和Bcl-2

9、家族成員的表達(dá)均有顯著影響。阿霉素脂質(zhì)體通過(guò)增加細(xì)胞表面的死亡受體密度增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。受體阻斷實(shí)驗(yàn)亦證明死亡受體在細(xì)胞表面表達(dá)的增加，對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體的協(xié)同增效起著關(guān)鍵性作用。Western blot結(jié)果表明，復(fù)方脂質(zhì)體增加了caspase-3，-8，-9的活化，顯示TRAIL啟動(dòng)了線粒體依賴和線粒體非依賴兩種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。另一方面，復(fù)方脂質(zhì)體促使細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡的蛋白Mcl-1，Bcl-2和Bcl-xl減少，促進(jìn)