重樓復(fù)方的篩選、提取工藝及抗腫瘤作用的研究.pdf

1、[目的]篩選重樓復(fù)方抗腫瘤作用的最佳組方，確定提取工藝和最佳處方配比，并考察其體內(nèi)外的抗腫瘤作用及機(jī)制。
　　 [方法]建立荷瘤(H22)小鼠模型，以抑瘤率為指標(biāo)觀察重樓與不同中藥配伍的體內(nèi)抑瘤作用，篩選出抗腫瘤作用的最佳組方.以體內(nèi)外抑瘤率為指標(biāo)，篩選重樓復(fù)方最佳提取工藝；采用正交設(shè)計(jì)以體內(nèi)抑瘤率為指標(biāo)確定最佳處方配比。采用MTT法研究重樓復(fù)方對(duì)12種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，流式細(xì)胞儀(FCM)險(xiǎn)測(cè)藥物作用后腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生和

2、對(duì)細(xì)胞周期的影響，RT-PCR儀檢測(cè)重樓復(fù)方對(duì)腫瘤細(xì)胞Survivin、c-IAP1、c-IAP2、Bel-2 mRNA表達(dá)的改變，免疫印跡法(Werstern-blot)測(cè)定對(duì)腫瘤細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的改變。予荷瘤(H22)小鼠灌胃重樓復(fù)方10天后，處死，剝離瘤體及脾臟，計(jì)算抑瘤率及脾指數(shù)，采用MTT法檢測(cè)CTL細(xì)胞毒性，并初步評(píng)價(jià)其安全性。
　　 [結(jié)果]
　　 1、確定重樓復(fù)方抗腫瘤作用的最佳組方為重樓，

3、連翹、黨參三藥組合。
　　 2、確定重樓復(fù)方最佳提取工藝為：重樓粉碎成粗粉，加入8倍量80％乙醇加熱回流提取3次，每次2小時(shí)。連翹加入12倍量80％乙醇加熱回流提取2次，每次1.5小時(shí)。黨參加入10倍量蒸餾水100℃回流提取2次，每次3小時(shí)，過(guò)濾，水浴濃縮至1ml藥液/g生藥，加入乙醇使含醇量達(dá)到90％，于4℃冰箱靜置24小時(shí)，取沉淀，60℃干燥。
　　 3、確定重樓復(fù)方抗腫瘤作用的最佳處方配比為重樓：連翹：黨參按10:

4、5:5進(jìn)行組方。
　　 4、重樓復(fù)方對(duì)多種不同組織來(lái)源的12種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值在0.202～0.673mg/ml之間，具有較廣譜的抗腫瘤活性.可誘導(dǎo)SMMC-7721、MKN-45細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且隨著藥物濃度的增加，其誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)；并能阻滯SMMC-7721、MKN-45細(xì)胞周期停滯在G0/G1期.重樓復(fù)方可下調(diào)MKN-45，SMMC-7721凋亡抑制基因Survivin、c-IAP1、c-IAP2

5、、Bcl-2 mRNA的表達(dá)；下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)及上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax/Bcl-2的比值。
　　 5、不同劑量的重樓復(fù)方均能抑制荷H22小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，高中低劑量組抑瘤率分別為54.84％、54.38％、37.37％，與對(duì)照組比較具有顯著性意義(P<0.01)。重樓復(fù)方可明顯提高荷H22小鼠脾指數(shù)及CTL細(xì)胞殺傷活性；對(duì)小鼠的肝腎功能及白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白均沒(méi)有顯著影