Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質(zhì)瘤細胞株的增殖及凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一類惡性程度非常高的腦部腫瘤,由于該腫瘤的高侵襲性、耐藥性、抗放療性、早期轉(zhuǎn)移、原位復(fù)發(fā)等特性,大部分的患者的生存期都很短,只有1年左右。本研究首先利用RT-PCR法檢測Notch受體及其靶基因Hes-1在U87、U251膠質(zhì)瘤細胞中的表達.由于Hes-1是Notch通路調(diào)節(jié)的主要靶基因之一,通過檢測Hes-1基因的表達水平即可確定Notch通路的活化程度。因此,我們以熒光定量RT-PCR.法

2、定量分析GSI-Ⅰ對Notch通路的抑制作用；同時,應(yīng)用MTT法分析GSI-Ⅰ和抗腫瘤藥物博來霉素(Bleocin,BLM)對上述兩種細胞的增殖抑制作用。下一步,我們利用流式細胞儀檢測了GSI-Ⅰ和BLM對U251、U87這兩種細胞株的細胞周期影響及誘導(dǎo)凋亡的作用。最后,采用蛋白印跡(western blot)技術(shù)進一步分析了GSI-Ⅰ對U251、U87細胞的周期蛋白表達的影響。
　　 方法：
　　 1.U87和U251

3、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的培養(yǎng)
　　 U87、U251膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置37℃、5％的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng),實驗取對數(shù)生長期細胞。
　　 2.notch信號通路受體及其下游基因Hes-1的檢測
　　 取對數(shù)生長期的U87、U251膠質(zhì)瘤細胞,按照Trizol說明書提取總RNA,行RT-PCR檢測notch受體及其下游基因Hes-1的表達。
　　 3.GSI處理后Hes-1表達水平的檢測

4、
　　 U87膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)1 μ mol/L GSI和2.5 μ mol/L GSI分別處理4h,24,48h后,提取總RNA行熒光定量RT-PCR檢測Hes-1的表達水平。
　　 4.檢測GSI處理后對U87和U251膠質(zhì)瘤細胞增殖能力的的影響
　　 取生長良好的U87和U251細胞細胞,用不同濃度的GSI處理,實驗同時設(shè)陰性對照組,48h后,置酶標(biāo)儀570nm波長測各孔OD值,分析細胞的增殖能力。
　　

5、 5.檢測GSI+Bleocin對U87、U251膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用的協(xié)同效應(yīng)
　　 實驗分為陰性對照組、GSI各濃度組、Bleocin各濃度組及GSI+Bleocin各濃度組,處理48h后MTT法分析GSI、Bleocin和GSI+Bleocin對U87和U251細胞的增殖抑制作用。
　　 6.GSI對U87和U251細胞周期的檢測
　　 U87和U251細胞經(jīng)GSI處理48h后,收集細胞并用70％的乙醇固

6、定至少6小時,流式細胞儀分析GSI分別對U87和U251細胞周期各期的作用,同時,利用蛋白印跡檢測GSI對U87和U251細胞周期蛋白的影響。
　　 7.檢測GSI、Bleocin、GSI+Bleocin對U87和U251細胞凋亡的影響
　　 不同濃度的GSI、Bleocin、GSI+Bleocin處理后,收集細胞,Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測GSI對膠質(zhì)瘤細胞株U87、U251的誘導(dǎo)調(diào)亡作用。
　

7、　 8.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理,熒光定量RT-PCR實驗采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,細胞周期實驗采用獨立樣本的t檢驗,細胞增殖抑制實驗、凋亡分析實驗采用方差分析,GSI+Bleocin協(xié)同效應(yīng)實驗采用析因設(shè)計的方差分析。
　　 本實驗的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.成功培養(yǎng)了人源性的U87、U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株,通過RT-PCR法,檢測到notch受體及notch信號

8、通路下游的靶基因Hes-1在U87、U251膠質(zhì)瘤細胞株中均有表達,說明notch信號通路在LJ87、U251膠質(zhì)瘤細胞中是存在的。
　　 2.用GSI-Ⅰ處理U87、U251膠質(zhì)瘤細胞4～48小時,經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,不同濃度的GSI分別處理4h,24h,48h后,Hes-1的表達顯著下降,差異具有統(tǒng)計意義(F=14.965,P=0.000)。以上結(jié)果說明經(jīng)GSI處理后,notch信號通路下游靶基因Hes-1

9、的表達與control組相比顯著性降低,并呈現(xiàn)出劑量依賴性,說明GSI-ⅠI能有效抑制U87、U251膠質(zhì)瘤細胞中的notch信號通路的活性。
　　 3.檢測了不同濃度的GSI-Ⅰ對U87、U251膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制作用,48h后行MTT法檢測,結(jié)果顯示,2.5μmol/L及以上濃度的GSI能顯著抑制這兩種腫瘤細胞的增殖,差異具有顯著性(F=11.174,P=0.000)和(F=92.755,P=0.000)。說明2.5μmol

10、/L及以濃度的GSI對U87、U251膠質(zhì)瘤細胞有顯著的增殖抑制作用,且該抑制作用呈劑量依賴型增加。而低濃度的GSI-Ⅰ(0.5μmol/L或1μmol/L)對細胞的抑制作用無顯著差異,說明GSI-Ⅰ對膠質(zhì)瘤細胞有毒作用,但必須達到一定的濃度。
　　 4.本實驗研究了BLM+GSI對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制是否具有協(xié)同效應(yīng)。實驗證明BLM+GSI比單用GSI處理對U87和U251細胞的增殖抑制作用更加顯著,有統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.2

11、17,P=0.000)和(F=3.863,P=0.001)。說明GSI+BLM聯(lián)用對膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng),我們推測,BLM抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的機理可能與其它腫瘤相似,也是通過作用于神經(jīng)膠質(zhì)痛細胞的增殖周期而抑制其增殖。
　　 5.為了進一步闡明GSI-Ⅰ抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的機制,實驗中首先我們通過流式細胞儀檢測了GSI-Ⅰ對U87及U251細胞周期的影響。加入DMSO或2.5μmol/L的GSI-ⅠⅠ作用48

12、h后,收集細胞并行細胞周期的檢測,結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ作用于U87膠質(zhì)瘤后,處于S期的細胞顯著減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異,同時G1期細胞增多,說明GSI-Ⅰ使U87細胞阻滯在G1期。在U251細胞中也檢測到S期細胞減少,但G1期細胞同樣減少,并且G2期細胞顯著增加,說明GSI-Ⅰ對U251細胞的作用主要是G2期阻滯。G1期阻滯說明細胞增殖受到抑制,而G2期阻滯則意味著凋亡即將發(fā)生。
　　 下一步我們采用蛋白印跡(western blo

13、t)分析了GSI對U87及U251細胞周期蛋白Akt、S6K、CDK2、Cyclin B1和CyclinD1表達的影響。U87、U251膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)不同濃度的GSI(1μmol,2.5μmol,5μmol,10μmol)處理48h后,提取不同處理組總蛋白,檢測Akt、S6K、CDK2、CyclinB1和CyclinD1表達的表達。結(jié)果顯示,GSI-Ⅰ作用后兩種細胞的Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87細胞的Cyclin D1表達下

14、調(diào),U251細胞的Cyclin B1表達下調(diào),兩種細胞的CDK2都有明顯下調(diào)。說明GSI-Ⅰ對膠質(zhì)痛細胞株的抗凋亡及細胞周期蛋白的活性及表達有影響。這可能是GSI-Ⅰ抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)的分子機制之一。從上述結(jié)果分析,GSI-Ⅰ對膠質(zhì)瘤細胞的毒性作用不僅體現(xiàn)在抑制增殖,還可能直接誘導(dǎo)凋亡。因此,我們進一步檢測了GSI-Ⅰ對這兩種膠質(zhì)瘤細胞株的促凋亡作用。
　　 6.實驗中我們分別用不同濃度度的GSI-Ⅰ作用于U87及U251膠質(zhì)瘤細胞,

15、作用時間分別是24h和48h,結(jié)果顯示,GSI作用24h后,隨差GSI濃度的增加,U87細胞的調(diào)亡率增加(從2.24±0.23％上升到7.63±0.63％),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=116.545,P=0.000),U251細胞的調(diào)亡率也有增加(從2.72±0.73％上升到6.17±0.45％),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.734,P=0.001),作用48h后,U87和U251細胞的調(diào)亡率也顯增加,具有統(tǒng)計學(xué)差異(分別為F=144.65

16、1,P=0.000:F=211.295,P=0.000)。以上結(jié)果說明GSI-Ⅰ作用于膠質(zhì)瘤細胞有顯著的促凋亡作用,而該作用在不同的膠質(zhì)瘤細胞株中存在差異。U251細胞較之U87細胞更容易被GSI-Ⅰ誘導(dǎo)凋亡。
　　 7.我們還進一步分析了GSI-Ⅰ、Bleocin和Bleocin+GSI對U87、U251膠質(zhì)痛細胞的促凋亡作用,用1 μmol/L GSI-Ⅰ,1μmol/L Bleocin,1μmol/LGSI-Ⅰ+1μmol

17、/L Bleocin處理U87膠質(zhì)瘤細胞,用2.5μmol/L GSI-Ⅰ.1 μmol/LBleocin,2.5μmol/L GSI-Ⅰ+lμmol/L Bleocin處理U251細胞,48h后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率,結(jié)果顯示,1μmol/L的GSI-Ⅰ對U87細胞的調(diào)亡率為9.217±0.440％(P=0.000),1μmol/L的Bleocin對U87細胞的調(diào)亡率為8.343±0.778％(P=0.001),1μmol/L

18、GSI-Ⅰ+lμmol/L Bleocin對U87細胞的調(diào)亡率為21.160±1.423％(P=0.000)。2.5μmol/L GSI-Ⅰ對U251細胞的調(diào)亡率為21.883±2.054％(P=0.000),lμmol/L的Bleocin對U251細胞的調(diào)亡率為8.343±0.776％(P=0.015),2.5μmol/L GSI-Ⅰ+1μmol/L Bleocin對U251細胞的調(diào)亡率為60.980±2.015％(P=0.000)。