N-Myc基因活性對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、目的: 檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中N-Myc基因的表達(dá)，探討N-Myc基因?qū)δz質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　 方法:
　　 （1）膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：用免疫磁珠分選法分選出高純度的CD133+細(xì)胞,培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分四組：空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照、siRNA陰性對(duì)照、siRNA組。
　　 （2）提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 檢測(cè)CD133-細(xì)胞和CD133+細(xì)胞中N-Myc mRNA的表達(dá)。提取

2、細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)CD133-細(xì)胞和CD133+細(xì)胞中N-Myc蛋白的含量。
　　 （3）根據(jù)體外合成siRNA的設(shè)計(jì)原則，合成N-Myc siRNA。
　　 （4）陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將N-Myc siRNA轉(zhuǎn)染CD133+細(xì)胞。RT-PCR、Western Blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 CD133+細(xì)胞內(nèi)N-Myc mRNA水平和蛋白含量。
　　 （5）MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CD133+細(xì)胞增殖，流

3、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+細(xì)胞周期，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果: CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的N-Myc mRNA和蛋白水平較低，而CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的N-Myc mRNA和蛋白水平較高。轉(zhuǎn)染N-Myc siRNA后，與對(duì)照組相比，siRNA組CD133+細(xì)胞中的N-Myc mRNA和蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05）。MTT法檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，siRNA組CD133+細(xì)胞增殖明顯

4、受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示：與對(duì)照組相比，siRNA組G0/G1期CD133+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯增高，S期CD133+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡顯示：與對(duì)照組相比，siRNA組CD133+細(xì)胞凋亡率明增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05）。
　　 結(jié)論: N-Myc在膠質(zhì)瘤CD133+細(xì)胞中高表達(dá)，抑制N-Myc表達(dá)可以阻礙膠質(zhì)瘤干