血管緊張素轉化酶2對于膠原及其限速亞單位P4Hα1的作用和機制研究.pdf

1、背景：
　　膠原是人體中細胞外基質（ECM）中主要的結構蛋白，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是血管壁結構中最常見的膠原蛋白亞型，其分泌和降解的平衡是維持細胞外基質正常，增加動脈斑塊穩(wěn)定以及降低血管壁破裂的重要因素。
　　眾所周知，4羥基-脯氨酸羥化酶（P4H）對于膠原蛋白的生物合成具有重要作用，它是一個具有兩個α亞基和兩個β亞基的四聚體，其中，α亞基決定其生物活性，足量的P4Hα1可以促進膠原蛋白的合成，而P4Hα1表達的降低也可相

2、應減少膠原蛋白的含量。
　　在人體內，腎素-血管緊張素系統與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關。其中，血管緊張素 Ⅱ（AngⅡ）可以引起血管收縮，血管平滑肌細胞增殖肥大以及誘導炎癥反應的產生。有關研究已經證明 AngⅡ可以抑制P4Hα1的活性和降低膠原的合成以破壞 ECM的結構，從而導致斑塊的不穩(wěn)定和破裂。在腎素血管緊張素系統中的另一物質血管緊張素轉化酶2（ACE2），具有與 AngⅡ的反作用，可發(fā)揮很強的抗炎癥反應作用，并可促進膠原

3、的合成以及斑塊的穩(wěn)定，而且可將 AngⅡ水解為血管緊張素（1-7）（Ang（1-7）），后者作為 AngⅡ的內源性拮抗因子，可與 AngⅡ產生對抗作用。
　　目的：
　　1.在體外實驗中，觀察 ACE2是否可以促進 P4Hα1的表達并增加膠原蛋白含量。
　　2.在體外實驗中，研究并探討 ACE2對于 P4Hα1以及膠原合成的作用機制和途徑。
　　方法：
　　ACE2重組腺病毒的制備
　　通過 AdMa

4、x系統制備攜帶 ACE2的重組腺病毒（AdACE2）以及增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的重組腺病毒（AdEGFP）。
　　對細胞的預處理
　　用10-6mol/L的AngⅡ刺激平滑肌細胞24小時。24小時候再對細胞進行分組刺激。
　　對細胞的刺激
　　用106pfu AdEGFP刺激細胞24小時以及用相同劑量的AdACE2刺激細胞24,48,72小時來研究 ACE2對 P4Hα1的作用。為了研究 Ang（1-

5、7）的作用，在時間效應實驗中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激細胞2,4,8,16,24小時；在劑量效應實驗中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分別刺激細胞24小時。接下來，為了分析 ACE2的作用機制，用Ang(1-7)的抑制劑 A779來作對比，將實驗分為六組，每組刺激24小時，除了ACE2為106pfu外，Ang(1-7)和A779都是10-6mol/L，具體分組為對照組，

6、AdACE2組，AdACE2+A779組，Ang(1-7)組,Ang(1-7)+A779組和A779組。
　　實時定量 RT-PCR
　　細胞刺激結束后，提取細胞的RNA并進行逆轉錄，使用實時定量RT-PCR檢測 P4Hα1的mRNA含量，并通過β-actin的CT值進行校準。
　　Western blot
　　提取經過刺激的細胞的蛋白質后，通過進行凝膠電泳，轉膜，談后標記一抗和二抗，進而曝光，最后可以觀察到目的

7、蛋白的表達。
　　ELISA
　　將細胞的上清液提取出來以后，使用ELISA試劑盒分析得出膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表達含量。
　　結果：
　　ACE2促進 P4Hα1的表達
　　在時間效應實驗中，用106pfu AdACE2分別刺激細胞24,48,72小時，通過 RT-PCR發(fā)現24小時后，P4Hα1的表達最強烈，明顯高于其他各組，到48小時時表達已降低，72小時與48小時時差別不大，但都高于對照組以及AdEGFP

8、組。
　　Ang(1-7)增加 P4Hα1的表達
　　對于 Ang(1-7)對 P4Hα1的作用效果，在時間效應實驗中，用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激細胞2,4,8,16,24小時，發(fā)現其效果隨時間逐步上升并在24小時時達到最高且明顯高于對照組；在劑量效應實驗中，用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分別刺激細胞24小時，結果顯示，其作用效果隨濃度的上升而上升，在其后的實

9、驗中，選取10-6mol/L作為 Ang(1-7)的作用濃度。
　　A779抑制ACE2和Ang（1-7）對于 P4Hα1的作用
　　為了研究 ACE2對于 P4Hα1的作用機制，除了用AdACE2和Ang(1-7)刺激細胞外，還使用了Ang(1-7)的抑制劑 A779與兩者混合刺激。根據 RT-PCR以及Western的結果，單純 Ang(1-7)的刺激要比單純 ACE2的刺激作用大的多，加入抑制劑后，A779可以幾乎全部

10、抑制Ang(1-7)的作用但是只是部分抑制了ACE2，單純的A779刺激使得 P4Hα1表達比對照組更低。說明 ACE2對 P4Hα1的作用途徑是通過對 AngⅡ的降解來提高 Ang(1-7)，而Ang(1-7)是直接產生促進作用。
　　ACE2提高膠原蛋白的含量
　　通過 ELISA分析，膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的含量在 ACE2和Ang(1-7)刺激下明顯升高，且前者高于后者。A779加入后，ACE2的作用大約60％被抑制，而An