異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑的神經(jīng)保護(hù)和促胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究.pdf

1、淫羊藿(Herba EPimedii)是一味經(jīng)典的補(bǔ)益中藥，具有改善心腦血管系統(tǒng)功能、防治骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效。其主要有效成分淫羊藿苷(icaritin，ICA)為異戊烯基黃酮苷類化合物，淫羊藿素(icaitin，ICT)和去甲淫羊藿素(desicaritin，DICT)是ICA的體內(nèi)代謝組分，也有少量存在于淫羊藿中。鑒于大豆黃素前體經(jīng)脫糖基去甲基后所形成的苷元呈現(xiàn)雌激素樣作用，本研究采用類似的結(jié)構(gòu)修飾思路制備而得

2、ICT和DICT。采用MCF-7/BOS細(xì)胞增殖試驗(yàn)(E-SCREEN法)檢測此三個(gè)化合物是否具有雌激素樣活性并對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索，在此基礎(chǔ)上論文第二章拓寬了對異戊烯基黃酮類結(jié)構(gòu)類似物的雌激素樣活性構(gòu)效關(guān)系研究。 鑒于許多難治性復(fù)雜疾病如神經(jīng)退行性改變等均與體內(nèi)雌激素水平的異常相關(guān)，而雌二醇具有神經(jīng)保護(hù)作用并在神經(jīng)發(fā)育分化中發(fā)揮重要作用。本論文進(jìn)一步探討了異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)分化方面的可能活性和機(jī)制，旨

3、在為此類植物來源的雌激素受體調(diào)節(jié)劑防治神經(jīng)退行性改變的活性提供依據(jù)。 第一章淫羊藿素及去甲淫羊藿素的雌激素樣活性及機(jī)制研究為評價(jià)lCA、ICT和DICT的雌激素樣活性并對機(jī)制進(jìn)行探索，本研究采用E-SCREEN法和雌激素受體效應(yīng)基因檢測法相結(jié)合進(jìn)行活性評價(jià)。實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測細(xì)胞數(shù)量，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化，RT-PCR法檢測雌激素受體效應(yīng)基因表達(dá)變化，并運(yùn)用雌激素受體拮抗劑ICI 182,780作為工具藥對雌激素受體依賴

4、性進(jìn)行評價(jià)。 第二章異戊烯基黃酮類衍生物雌激素樣活性構(gòu)效關(guān)系研究及機(jī)制探討基于ICA、ICT和DIGT由于取代基團(tuán)不同帶來的雌激素活性差異，本研究對系列異戊烯基結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行了進(jìn)一步考察，采用生物活性評價(jià)和計(jì)算機(jī)輔助受體一配體對接實(shí)驗(yàn)(DOCKING)相結(jié)合的方法對異戊烯基黃酮類化合物的雌激素樣活性構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步探索。 第三章異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑淫羊藿素對Aβ肽所致大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用近年來，雌

5、激素在防治神經(jīng)退行性改變中的作用受到極大關(guān)注，但對其治療地位和作用機(jī)理尚存在較大爭議，雌激素對阿爾茨海默病(AIzheimer’s Disease，AD)的治療地位與價(jià)值也遠(yuǎn)未闡明亟待獲得肯定。鑒于雌二醇對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，本研究對異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑在AD防治中的潛在價(jià)值及其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。由于淀粉樣蛋白所致神經(jīng)損傷是AD的重要病理基礎(chǔ)之一，Aβ25-35則是β淀粉樣蛋白的毒性片斷，本實(shí)驗(yàn)采用Aβ25-35致原代培養(yǎng)大

6、鼠胚胎神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷模型，用以評價(jià)異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑的神經(jīng)保護(hù)作用并對機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察評價(jià)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量檢測評價(jià)細(xì)胞生存狀況，AO／EB染色用于初步評價(jià)細(xì)胞凋亡情況，JC-1染色法評價(jià)細(xì)胞膜電位的變化，WesternBlot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明，ICT能夠濃度依賴性地抵抗Aβ25-35所致的神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞生存

7、率升高，培養(yǎng)基中LDH釋放減少，神經(jīng)元染色質(zhì)固縮減少。該過程與神經(jīng)細(xì)胞線粒體跨膜電位(△ψm)改變及Bcl-2家族蛋白表達(dá)變化有關(guān)。ICT能抵抗Aβ25-35所致神經(jīng)細(xì)胞Aψm損失，上調(diào)抗凋亡蛋白Bc1-2的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該活性能被雌激素受體拮抗劑ICI182，780部分拮抗，表明該作用是雌激素受體依賴性的；ERK-MAPK抑制劑PD98059也能部分拮抗ICT的神經(jīng)保護(hù)作用，表明ERK-MAPK通路也參與了該神經(jīng)保護(hù)過程

8、。 第四章異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑淫羊藿素對小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用AD是以神經(jīng)元損傷丟失為特征的難治性神經(jīng)退行性疾病，細(xì)胞移植治療是未來的治療前景之一。目前，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能用于退行性改變的細(xì)胞替代治療，及藥物介入細(xì)胞替代治療的前景已引起關(guān)注。主要研究進(jìn)展集中在簡化誘導(dǎo)步驟，縮短誘導(dǎo)時(shí)間及控制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生途徑接近體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生過程

9、等方面。與此同時(shí)，部分研究表明，某些小分子藥物可通過調(diào)節(jié)ES細(xì)胞微環(huán)境控制其分化命運(yùn)，為ES細(xì)胞的定向分化開辟了新思路。 上述研究結(jié)果提示，ICT可經(jīng)由雌激素受體和ERK-MAPK通路保護(hù)原代培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)細(xì)胞免受損傷，提示發(fā)育中神經(jīng)細(xì)胞可能存在ICT作用環(huán)節(jié)。而且有研究表明，某些小分子藥物可通過調(diào)節(jié)ES細(xì)胞微環(huán)境控制其分化命運(yùn)。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的模型，旨在探索異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑對ES細(xì)胞分

10、化神經(jīng)細(xì)胞潛在的促進(jìn)作用，并對分化過程中的生物信息變化和分化機(jī)制作初步研究。實(shí)驗(yàn)采用維甲酸(Retinoicacid，RA)作為陽性藥，采用4-4+擬胚體分化法構(gòu)建ES細(xì)胞分化模型，用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的方法評價(jià)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中的形態(tài)學(xué)變化，用流式細(xì)胞儀檢測藥物誘導(dǎo)下神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋nestin和神經(jīng)元標(biāo)志蛋白B-TublinIII陽性表達(dá)細(xì)胞情況，采用RT-PCR和Westem Blot法檢測ES細(xì)胞分化過

11、程中基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示ICT(0.01-1 μmol/L)和RA(0.1μmol/L)能促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，顯著增加ES細(xì)胞分化而來的前體細(xì)胞(d 9+0)和成熟神經(jīng)元細(xì)胞(d 8+10)數(shù)量。RT-PCR法檢測發(fā)育標(biāo)志基因結(jié)果顯示，ICT和RA能增加ES細(xì)胞發(fā)育過程中中胚層和外胚層發(fā)育基因Fgf、Branchy的表達(dá)，并延長表達(dá)時(shí)相。Westem Blot結(jié)果顯示，神經(jīng)標(biāo)志蛋白B-Tublin III和膽堿能神經(jīng)標(biāo)

12、志蛋白(膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶，ChAT)在分化后期(d8+0開始)表達(dá)不斷增加。d 8+5和d 8+10，RA和ICT處理組β-TublinIII、ChAT蛋白表達(dá)顯著增加，提示RA和ICT具有促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用，并且分化的細(xì)胞中包含膽堿能神經(jīng)。分化機(jī)制初步探索結(jié)果顯示，ICT組和RA組p38磷酸化水平較溶劑對照組低，而ERK磷酸化水平略為偏高。鑒于p38在ES細(xì)胞定向分化過程的分子開關(guān)作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ICT可能是通過抑制

13、p38蛋白磷酸化的途徑促進(jìn)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。為論證異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑上述促分化共性作用，進(jìn)一步對IBA進(jìn)行了促定向分化作用檢測。結(jié)果顯示，其促ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)細(xì)胞作用與lCT相近似，而ICA則無明顯的活性，表明具有雌激素樣活性的異戊烯基黃酮可能具有此類促分化共性作用，該活性與雌激素受體調(diào)節(jié)作用呈相關(guān)性。第五章生物活性導(dǎo)向法分離中藥補(bǔ)骨脂中異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑前述實(shí)驗(yàn)表明，IBA具有較強(qiáng)的雌激素樣活性。鑒于

14、ICT來源于補(bǔ)益中藥淫羊藿，IBA也是補(bǔ)益中藥補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分之一，本研究采用E-SCREEN生物活性導(dǎo)向法分離補(bǔ)骨脂的異戊烯基黃酮類雌激素樣活性組分，旨在為進(jìn)一步作構(gòu)效關(guān)系研究提供化合物來源。 本研究采用醇提法獲取補(bǔ)骨脂藥材粗提品，以液液萃取、柱層析分離、HPLC分析、LC-MS、NMR結(jié)構(gòu)解析為主要方法，以E-SCREEN法評價(jià)各層次組分雌激素樣活性(生物活性導(dǎo)向)進(jìn)行逐步分離。最終得4個(gè)雌激素活性化合物，其中三個(gè)為異戊烯基

15、黃酮類化合物，分別為異補(bǔ)骨脂查爾酮(isobavachalcone)、新異補(bǔ)骨脂黃酮(neobavaisoflavone)和8-異戊烯基大豆素(8-prenyldaidzein)。本研究工作為補(bǔ)益中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)后續(xù)研究提供了重要線索。結(jié)論1、ICT、DICT和IBA等異戊烯基黃酮類化合物具有雌激素樣作用，該作用經(jīng)由雌激素受體介導(dǎo)，通過調(diào)控雌激素受體效應(yīng)基因蛋白表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮作用，是一類新型結(jié)構(gòu)的植物來源雌激素受體調(diào)節(jié)劑。

16、 2、異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑構(gòu)效關(guān)系具有以下特點(diǎn)：異戊烯基是此類化合物的重要共性特征之一；取代基位置和疏水性強(qiáng)弱可影響其內(nèi)在活性；與雌激素受體的親和力大小是影響其活性強(qiáng)弱的主要因素之一，分子中糖基取代可影響受體一配體親和力而使其喪失活性。 3、ICT具有抗Aβ25-35所致原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用，該作用能被雌激素受體拮抗劑ICI 182,780和ERK．MAPK激酶抑制劑PD 98059部分阻斷。表明該保護(hù)作用是通

17、過雌激素受體介導(dǎo)，并與ICT上調(diào)Bc1-2蛋白，阻斷線粒體凋亡通路有關(guān)。 4、ICT和IBA具有誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞(含ChAT陽性表達(dá)細(xì)胞)的作用，是一類有前景的分化誘導(dǎo)劑；該類異戊烯基黃酮雌激素受體調(diào)節(jié)劑的促分化作用與雌激素樣活性有關(guān)，但并不完全通過ER依賴性途徑發(fā)揮作用，ICT引起的p38低磷酸化水平可能是此類化合物促分化的重要因素。 5、同屬補(bǔ)益中藥的淫羊藿與補(bǔ)骨脂中，含有多種具有雌激素樣作用異