脂肪細(xì)胞及脂肪因子調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和耐藥的研究.pdf

1、第一部血清脂肪因子水平與多發(fā)性骨髓瘤疾病的關(guān)系
　　目的：肥胖是腫瘤發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素，某些脂肪因子血清水平同腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)有一定的聯(lián)系，并同腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥行為密切相關(guān)，本部分通過檢測(cè)MM患者血清脂肪因子水平，評(píng)估脂肪因子水平在MM中的意義。
　　方法：采用ELISA檢測(cè)28例新診斷的MM患者血清中脂肪因子(瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、內(nèi)脂素)的水平，選取28例性別和年齡匹配的健康的體檢者作為對(duì)照組。研究這些脂肪因子水

2、平同MM發(fā)病的關(guān)系；以及同MM疾病分期和MM相關(guān)預(yù)后指標(biāo)（如骨髓漿細(xì)胞％、?2微球蛋白和血沉）、常規(guī)生化指標(biāo)（LDH、ALB、GLB、Ca2+）的相關(guān)性。
　　結(jié)果：多發(fā)性骨髓瘤患者血清瘦素水平明顯高于對(duì)照組（6.82+3.09ng/ml，2.91+1.81ng/ml，p<0.01）且較高疾病分期患者（III期）血清瘦素水平明顯高于較低疾病分期患者（I期和II期）；而骨髓瘤患者脂聯(lián)素水平明顯低于對(duì)照組(5.79+2.37μ g/m

3、l,9.29+3.45μ g/ml,p<0.01),同時(shí)較高疾病分期患者（III期）血清脂聯(lián)素水平明顯低于較低疾病分期MM患者（I期和II期）。這提示更低的脂聯(lián)素水平和更高的瘦素水平同患MM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在MM患者中，MM患者血清瘦素水平和血清IgG濃度（r=0.607，p=0.001）、骨髓漿細(xì)胞比例（r=0.513,p=0.005）、β2微球蛋白（r=0.572,p=0.01）,血沉（r=0.374，p=0.05）顯著正相關(guān)；同白蛋白水

4、平（r=-0.546，p=0.003）顯著負(fù)相關(guān);而同LDH（r=-0.014，p=0.943），血紅蛋白濃度（r=-0.279,p=0.151）、血清鈣濃度（r=-0.275，p=0.156）無相關(guān)性。MM患者脂聯(lián)素水平同IgG濃度（r=-0.575，p=0.001）、β2微球蛋白（r=-0.577,p=0.001）、血沉（r=-0.441，p=0.019）顯著負(fù)相關(guān);同白蛋白水平（r=0.517,p=0.005）顯著正相關(guān)。而與骨髓

5、 MM細(xì)胞比例（r=-0.065,p=0.741）、LDH（r=-0.179,p=0.362）、血紅蛋白濃度（r=0.262，p=0.179）、血清鈣濃度（r=0.264,p=0.175）無相關(guān)性。內(nèi)脂素和抵抗素同任何一個(gè)MM預(yù)后指標(biāo)無相關(guān)性。
　　結(jié)論：瘦素在多發(fā)性骨髓瘤患者中水平升高，脂聯(lián)素在骨髓瘤患者中水平降低，因此我們推測(cè)脂聯(lián)素在機(jī)體中是一個(gè)保護(hù)因素，而瘦素則增加患上MM的風(fēng)險(xiǎn)。此外血清瘦素水平以及脂聯(lián)素水平同 MM臨床指

6、標(biāo)具有相關(guān)性提示脂肪因子可能對(duì)多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后評(píng)估具有一定的參考意義。
　　第二部分脂肪細(xì)胞通過瘦素/瘦素受體調(diào)節(jié)MM細(xì)胞增殖與耐藥
　　目的：體外實(shí)驗(yàn)探討脂肪細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子瘦素對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：選取能穩(wěn)定誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞系3T3-L1，以油紅O的方法對(duì)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定，用 ELISA法檢測(cè)其上清分泌的瘦素水平，同時(shí)取正常人骨髓，從中分離MSCs，將其分化誘

7、導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，用ELISA方法檢測(cè)其上清瘦素水平。不同的條件處理細(xì)胞： MM細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；MM細(xì)胞系同3T3-L1脂肪細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)；MM細(xì)胞系同3T3-L1脂肪細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)同時(shí)加入瘦素/OB抗體；CFSE的方法檢測(cè)MM細(xì)胞系增殖情況，PI單標(biāo)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)MM細(xì)胞系細(xì)胞周期；脂肪細(xì)胞同MM細(xì)胞共培養(yǎng)，western blotting檢測(cè)脂肪細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclinD1及信號(hào)通路蛋白AKT及STAT3磷酸化水

8、平的影響。檢測(cè)脂肪細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞耐藥的影響。將細(xì)胞不同條件處理：MM細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)同時(shí)加入硼替佐米（或地塞米松）； MM細(xì)胞同脂肪細(xì)胞直接共培養(yǎng)同時(shí)加入硼替佐米（或地塞米松）；采用Annexin V FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo) MM細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)用 western blotting的方法檢測(cè)脂肪細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和凋亡蛋白caspase-3表達(dá)。
　　結(jié)果：1）3T3-L1細(xì)胞

9、系能穩(wěn)定分化為脂肪細(xì)胞，分化率在80%-90%左右，將其作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。2）3T3-L1脂肪細(xì)胞和人MSCs分化的脂肪細(xì)胞均分泌瘦素。3T3-L1脂肪細(xì)胞上清瘦素濃度為：0.88+0.17ng/ml，MSCs分化的脂肪細(xì)胞上清瘦素濃度為：1.52+0.12ng/ml3）MM細(xì)胞系同3T3-L1直接共培養(yǎng)可促進(jìn)MM細(xì)胞系的增殖，其中細(xì)胞系U266和NCI-H929的增殖較對(duì)照組具有顯著差異，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取這兩種細(xì)胞系進(jìn)行研究。4）3T3-L

10、1脂肪細(xì)胞同MM細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，加入抗瘦素/OB抗體后，脂肪細(xì)胞促進(jìn)MM細(xì)胞增殖的效應(yīng)被抑制。5）3T3-L1脂肪細(xì)胞同MM細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞周期，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)。6）共培養(yǎng)使信號(hào)通路AKT和STAT3磷酸化水平升高。加入瘦素/OB抗體時(shí)，AKT和STAT3的磷酸化水平下降。7）脂肪細(xì)胞與MM細(xì)胞共培養(yǎng)，硼替佐米或地塞米松對(duì)MM細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用被削弱，其中硼替佐米誘導(dǎo)凋亡的作用明顯被削弱8）加入硼替佐米的情況

11、下，3T3-L1脂肪細(xì)胞同MM細(xì)胞共培養(yǎng)上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2,保護(hù)MM細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化。
　　結(jié)論：脂肪細(xì)胞通過瘦素/瘦素受體激活A(yù)KT和STAT3信號(hào)通路，脂肪細(xì)胞同MM細(xì)胞共培養(yǎng)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白 cyclinD1和抗凋亡蛋白 Bcl-2，保護(hù) MM細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化從而促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，加強(qiáng)MM細(xì)胞耐藥，最終有助于MM細(xì)胞生存和發(fā)展。
　　第三部分瘦素激活JAK/STA

12、T-PI3K/AKT途徑促進(jìn)MM細(xì)胞增殖
　　目的：研究瘦素促進(jìn)MM細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用cck8法檢測(cè)人重組瘦素對(duì)MM細(xì)胞U266和NIL-H929的影響。以不同濃度人重組瘦素（25ng/ml-200ng/ml）處理MM細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)（12,24，48小時(shí)）檢測(cè)MM細(xì)胞增殖。檢測(cè)瘦素對(duì)細(xì)胞通路蛋白激活狀態(tài)。50ng/ml瘦素處理MM細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)AKT、STAT

13、3蛋白表達(dá)水平及AKT和STAT3磷酸化水平。JAK/STAT化學(xué)抑制劑AG490和PI3K化學(xué)抑制劑LY294002對(duì)瘦素誘導(dǎo)MM細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)細(xì)胞通路蛋白的影響。
　　結(jié)果：1）人重組瘦素以時(shí)間依賴方式促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，但不依賴濃度，人重組瘦素在濃度為50ng/ml的濃度下對(duì)MM細(xì)胞促增殖作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度大于50ng/ml，促增殖作用減弱。2）50ng/ml瘦素升高M(jìn)M細(xì)胞STAT3磷酸化水平，處理后6h磷酸化水平達(dá)最高

14、，50ng/ml瘦素升高M(jìn)M細(xì)胞AKT磷酸化水平,處理后1h磷酸化水平達(dá)最高。3） LY294002降低了MM細(xì)胞AKT磷酸化水平，而對(duì)總AKT蛋白水平及STAT3磷酸化水平無影響。AG490處理后，瘦素誘導(dǎo)升高的STAT3磷酸化水平和AKT磷酸化水平均降低，同時(shí)加入AG490和瘦素?zé)o法升高兩者的磷酸化水平。4）AG490和LY294002均可阻斷瘦素對(duì)MM細(xì)胞的增殖作用。
　　結(jié)論：人重組瘦素以時(shí)間依賴方式促進(jìn)MM細(xì)胞增殖。瘦素