長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理通過誘導(dǎo)自噬發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、背景：腦卒中是全世界致死的第二大原因和致殘的主要原因。腦卒中后的致殘往往會(huì)給患者帶來如偏癱，失語等后遺癥，使患者生活質(zhì)量大大下降，同時(shí)給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前關(guān)于腦卒中的發(fā)病機(jī)制已有大量的研究報(bào)道，但臨床上仍然缺少有效的治理措施。研究發(fā)現(xiàn)臨床上用于治療二型糖尿病的一線藥物二甲雙胍能夠有效的降低腦卒中發(fā)生率，并減少腦卒中后梗死面積，且其神經(jīng)保護(hù)作用與降糖作用并沒有明顯的關(guān)聯(lián)[1,2]。而二甲雙胍作為AMPK的激活劑，更引起了人

2、們的關(guān)注和研究。大量文獻(xiàn)報(bào)道AMPK作為能量的主要感受器和調(diào)節(jié)器在腦卒中發(fā)生后起著重要的作用,并能夠通過下游多種通路包括抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，抑制NF-kB，減輕炎癥介質(zhì)的釋放，緩解炎癥的損傷；抑制MMP-9的表達(dá)，增加了ZO-1等蛋白的表達(dá)，減輕血腦屏障的損傷；對PCG-a以及下游分子TFAM，NRF1的作用，增加線粒體的再生，抑制神經(jīng)元凋亡。
　　但是作為AMPK下游重要的調(diào)控靶點(diǎn)—自噬，在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后在腦卒中發(fā)揮何

3、種作用以及在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理AMPK的活性升高可能會(huì)影響腦組織的代謝增加糖酵解作用，促進(jìn)乳酸的水平增加以及對熱休克蛋白表達(dá)的影響尚未有所報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用C57BL/6小鼠，采用大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型進(jìn)行研究，以及利用抑制劑3-MA，Compound C等研究自噬在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理時(shí)的腦保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)一：檢測觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的：探討長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后缺血再灌注6

4、h AMPK活化水平的變化以及乳酸的水平
　　方法：1）觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后腦組織的保護(hù)作用。采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組：MCAO組和Met+MCAO組，建立MCAO模型，檢測缺血再灌注后24h小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分以及腦梗死容積。2）在缺血再灌注后早期6h AMPK的活化水平和乳酸的水平。采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，Sham組，Met組，MCAO組和Met+MCAO組，建立MCAO模型。觀察缺血再灌注后6h A

5、MPK活化水平的表達(dá)。3）觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后，缺血再灌注后24h后，缺血半暗帶凋亡細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)果：長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后能夠有效地減少小鼠腦缺血再灌注24h梗死面積，改善神經(jīng)行為學(xué)評分。在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理組缺血再灌注后6h時(shí) AMPK活化水平相比MCAO組反而降低,乳酸水平降低，缺血半暗帶細(xì)胞凋亡減少。
　　結(jié)論：長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后能夠起到腦保護(hù)作用，降低缺血再灌注6h AMPK的活化水平，降低乳酸水

6、平。
　　實(shí)驗(yàn)二自噬在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理的表達(dá)以及神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　目的：探討自噬在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理的表達(dá)以及作用的研究
　　方法：1）觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后自噬水平的變化。采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：Sham組、Met、MCAO組和Met+MCAO組。建立MCAO模型觀察在缺血再灌注后6h，24h的自噬的表達(dá)水平。免疫熒光觀察LC3的表達(dá)情況，western blot檢測LC3，Becli

7、n-1以及p62的表達(dá)。2）側(cè)腦室給予抑制劑3-MA后，觀察自噬對長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后腦保護(hù)作用的影響。采用 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組Met+MCAO、Veh+Met+MCAO組和3-MA+Met+MCAO組建立MCAO模型，檢測缺血再灌注后24h小鼠腦梗死容積以及神經(jīng)行為學(xué)評分3）側(cè)腦室給予抑制劑3-MA后，觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后自噬的表達(dá)水平。采用 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組Met+MCAO組、Veh+Met+MCA

8、O組和3-MA+Met+MCAO組,建立MCAO模型。western blot檢測LC3，Beclin-1以及p62的表達(dá)，檢測缺血再灌注后6h，24h的自噬水平的變化。。4）側(cè)腦室給予抑制劑3-MA后，觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后Hsp70表達(dá)水平。采用 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組 Met+MCAO、Veh+Met+MCAO組和3-MA+Met+MCAO組,建立MCAO模型，western blot檢測 Hsp70表達(dá)。5）腹腔注射

9、抑制劑Compound C后，觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后對腦保護(hù)作用的影響。采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組Met+MCAO組、Veh+Met+MCAO組和CC+Met+MCAO組,建立MCAO模型。檢測再缺血再灌注后24h小鼠腦梗死容積以及神經(jīng)行為學(xué)評分。6）觀察腹腔注射抑制劑Compound C后，檢測在缺血再灌注后6h，24h的自噬水平的變化。采用 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組 Met+MCAO、Veh+Met+MCAO組和C

10、C+Met+MCAO組,建立MCAO，western blot檢測LC3，Beclin-1以及p62的表達(dá)。7）腹腔注射抑制劑 Compound C后，觀察長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后缺血再灌注24hAMPK的活化表達(dá)水平及在缺血再灌注6h時(shí)乳酸的變化水平。采用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組 Met+MCAO組、Veh+Met+MCAO組和CC+Met+MCAO組,建立MCAO模型，western blot和乳酸試劑盒檢測。
　　結(jié)果：

11、長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理后在Met組6h，24h及Met+MCAO組在缺血再灌注6h，24h時(shí)免疫熒光顯示LC3表達(dá)增多以及western blot顯示自噬相關(guān)蛋白表達(dá)升高。在側(cè)腦室給予抑制劑3-MA后，3-MA+Met+MCAO組相比Met+MCAO組在缺血再灌注后24h腦梗死面積擴(kuò)大神經(jīng)行為學(xué)評分下降同時(shí) western blot結(jié)果顯示在3-MA+Met+MCAO組自噬的相關(guān)表達(dá)蛋白降低，且在缺血再灌注后24h時(shí)發(fā)現(xiàn)在3-MA+Met

12、+MCAO組Hsp70的水平也發(fā)生降低，證明自噬也參與了對Hsp70的調(diào)節(jié)。在腹腔注射抑制劑 Compound C后，發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)相比 Met+MCAO組，CC+Met+MCAO組腦梗死面積擴(kuò)大及神經(jīng)行為學(xué)評分下降而 CC+Met+MCAO組乳酸的水平與Met+MCAO組降低，在缺血再灌注24h時(shí) CC+Met+MCAO組相比Met+MCAO組AMPK活化水平也下降同時(shí)自噬的水平也明顯的降低，進(jìn)一步證實(shí)在長時(shí)程二甲雙胍預(yù)處理時(shí)自噬發(fā)揮