全氟化碳對脂多糖誘導(dǎo)的肺泡液體清除能力下調(diào)的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　ALI/ARDS患者肺泡液體清除相關(guān)離子通道表達(dá)和功能活性下降,肺泡液體清除能力受損,肺泡腔內(nèi)液體積聚增加,是導(dǎo)致呼吸窘迫的直接原因,與疾病預(yù)后差相關(guān)。通過改善肺泡液體清除能力,可能是未來救治ALI/ARDS的新思路。本研究探討全氟化碳對脂多糖誘導(dǎo)的肺泡液體清除相關(guān)離子通道表達(dá)及功能下調(diào)的保護(hù)作用。
　　方法:
　　(1)利用超聲細(xì)胞破碎儀制備PFC-in-DMEN;采用不同體積比的PFC-in-DMEM(

2、0％,10%,30%,50%)作用A549細(xì)胞0.5h、1h、2h、4h,優(yōu)化PFC作用最佳濃度和作用時(shí)間;
　　(2)用LPS(10ug/ml)干預(yù)A549細(xì)胞,建立肺損傷細(xì)胞模型;
　　(3)A549細(xì)胞分別采用DMEM培養(yǎng)基、LPS(10ug/ml)、10%PFC-in-DMEM、10%PFC-in-DMEM+LPS(10ug/ml)干預(yù)4h,采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測ENaC-α、β、γ,Na+-K+-ATP

3、ase-α1,β1,CNG1-α和AQP3 mRNA的變化;western-blot檢測ENaC-α、Na+-K+-ATPase-α1的蛋白表達(dá)變化;采用細(xì)胞Na+-K+-ATPase酶活性檢測試劑盒分析A549細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性。
　　結(jié)果:
　　(1)10%PFC作用A549細(xì)胞4hENaC-α和Na+-K+-ATPase-α1 mRNA表達(dá)的水平最高;
　　(2)LPS(10ug/ml)增加1L-

4、1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá),4h達(dá)到最高峰,6h呈下降趨勢,但仍高于對照組。LPS作用0.5h時(shí)ENaC-α和Na+-K+-ATPase-α1 mRNA輕度上升,1h后呈逐漸下降趨勢,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,4h下降最明顯(分別P=0.037,P=0.046);
　　(3)與對照組比較,LPS組ENaC-α、β,Na+-K+-ATPase-α1、β1的mRNA的表達(dá)和6h的ENaC-α、Na+-K+-ATPase-α1蛋白

5、的表達(dá)明顯降低,而ENaC-γ、CNG1-α、和AQP3無明顯降低;
　　(4)與LPS比較,PFC+LPS作用4h能顯著上調(diào)ENaC-α、γ,Na+-K+-ATPase-α1,β1和CNG1-α的mRNA表達(dá),顯著上調(diào)ENaC-α、Na+-K+-ATPase-α1的蛋白表達(dá);
　　(5)與LPS比較,PFC+LPS作用4h能顯著上調(diào)Na+-K+-ATPase活性(P=0.045)。
　　結(jié)論:
　　1.10ug

6、/ml LPS能導(dǎo)致A549細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-1β、IL-6和TNF-α等前炎癥因子,并使肺泡液體清除相關(guān)離子通道ENaC-α、β,Na+-K+-ATPase-α1、β1的mRNA的表達(dá)和6h的ENaC-α、Na+-K+-ATPase-α1蛋白的表達(dá)下降,表明ALI細(xì)胞模型成功,并可用于ALI時(shí)肺泡液體清除相關(guān)細(xì)胞研究。
　　2.PFC能直接提高正常A549細(xì)胞肺泡液體清除相關(guān)離子通道ENaC-γ和CNG1α mRNA和ENaC-