纖毛運送蛋白IFT25與IFT27基因分析及體內(nèi)外互作研究.pdf

1、纖毛內(nèi)運送(IFT)是纖毛內(nèi)運送顆粒在纖毛基部和其頂端之間進行的雙向運動。IFT顆粒由復合物A和B組成，分別至少含有8個和12個IFT蛋白分子。最新研究表明，纖毛是一種細胞天線，負責胞外信息向胞內(nèi)的傳遞，而IFT顆粒是纖毛生物生成和纖毛信號分子在纖毛和胞內(nèi)進行傳遞所必需的。目前已知纖毛物理缺失或其功能缺陷會導致糖尿病和肥胖等多種營養(yǎng)代謝疾病的發(fā)生，這一類病因此又被統(tǒng)稱為“纖毛病”。然而，目前的現(xiàn)狀是人們對調(diào)控纖毛內(nèi)運送的分子機制知之甚少

2、。
　　IFT25和IFT27是IFT-B復合物的小磷酸化蛋白和小G蛋白組分，由ift25和ift27編碼。
　　本研究通過對萊茵衣藻中IFT25及IFT27氨基酸序列進行生物信息學分析，我們得知二者在不同物種中高度保守。纖毛運送蛋白IFT25為親水性蛋白，IFT27為疏水性蛋白，二者皆無跨膜結(jié)構和信號肽，屬于非分泌型胞內(nèi)蛋白。
　　在體外相互作用的研究中，以pGEX-2T，pMAL-C2H為表達載體，將目的基因25和

3、ift27分別與上述兩種載體相連構成重組質(zhì)粒，然后導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達。通過Western blotting檢測得到IFT25與IFT27在體外表達的關系。由實驗結(jié)果可知，IFT25單獨表達時為可溶性蛋白，IFT27單獨表達時為水不溶性蛋白，而IFT25與IFT27共表達成的融合蛋白為水溶性蛋白。
　　在體內(nèi)相互作用研究中，采用基因沉默的方法，分別使IFT25或IFT27在細胞纖毛內(nèi)的表達量降低，以FLA1

4、0為內(nèi)參，Western blotting法檢測目標蛋白的表達量，探究其中一個表達量降低時，對另一蛋白表達量的影響。RNA水平分析發(fā)現(xiàn)，以野生型CC-125的表達量為對照，ift25基因沉默后，ift25基因的表達量降低而ift27表達量卻增高;然而ift27基因沉默后，ift27表達量降低而ift25不變。蛋白水平分析發(fā)現(xiàn)，IFT25蛋白水平降低時IFT27蛋白含量也隨之下降，而當IFT27蛋白水平降低時IFT25含量不變。