短肢矮小患兒的臨床特征及CTSK和IFT80基因的突變研究.pdf

1、身材矮小是指身高處于同年齡、同性別正常兒童生長(zhǎng)曲線第三百分位數(shù)以下或低于平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的兒童。根據(jù)外貌特征分為勻稱性和非勻稱矮小。非勻稱性矮小又分為短肢矮小和短軀干矮小。身材是否勻稱，是以坐高(頂臀長(zhǎng))與身高(長(zhǎng))的比例來判定的，坐高(頂臀長(zhǎng))占身高(長(zhǎng))的比例由出生時(shí)的0.67下降到14歲時(shí)的0.53，適應(yīng)這一比例，為身材勻稱。指間距反映上肢生長(zhǎng)情況。正常時(shí)指距略小于身高。RaoE[1]，報(bào)道矮小發(fā)病率為3％，國內(nèi)資料[2]報(bào)道發(fā)病

2、率0.64％。身材矮小且伴有短肢畸形嚴(yán)重影響患兒的身體、生理及心理健康，遺傳性骨病是這類疾病發(fā)病的重要原因也是目前研究的焦點(diǎn)。臨床上導(dǎo)致短肢矮小的疾病有軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia，ACH)，干骺端軟骨發(fā)育不良(Metaphyseal Chondrodysplasia Schmid type)，軟骨生成不全(Achondrogenesis，ACG)、軟骨外胚層發(fā)育不良(Ellis—Van Creveld syndrome，

3、EVC)、成骨不全(Osteogenesis imperfecta，OI)、致死性發(fā)育不良(Thanatophoric dysplasia，TD)、窒息性胸廓發(fā)育不良(Asphxiating thoracic dyaplasia)、短肋—多指綜合征(Short—rib polydactylia syndrome)、假性軟骨發(fā)育不全(Pseudoachondroplasia，PASACH)、軟骨發(fā)育低下(Hypochondroplasia

4、，HCH)及致密性骨發(fā)育障礙(Pycnodysostosis)等。這類疾病在臨床上都以身材矮小并短肢畸形為共同表現(xiàn)，但各自又有其特征性表現(xiàn)。缺乏這類疾病臨床特征的資料極大的限制了對(duì)這類疾病正確認(rèn)識(shí)及診斷。從而進(jìn)一步影響對(duì)這類疾病的深入研究。尤其是罕見疾病導(dǎo)致的短肢矮小如窒息性胸廓發(fā)育不良，致密性骨發(fā)育障礙等。目前國內(nèi)僅有少數(shù)病種進(jìn)行了基因水平的研究，如軟骨發(fā)育不全的致病基因進(jìn)行了研究報(bào)道[3]。國外已經(jīng)對(duì)多種導(dǎo)致短肢矮小的遺傳性骨病進(jìn)行

5、了基因水平的研究，其中包括對(duì)致密性骨發(fā)育不良的致病基因組織溶酶體K(Cathepsin K，CTSK)的突變研究。國外還報(bào)道了在窒息性胸廓發(fā)育不良的患兒中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白80(intraflagellar transport80，IFT80)基因的突變。導(dǎo)致短肢矮小的病因國外多年前已經(jīng)在基因水平上進(jìn)行了發(fā)病機(jī)制的探討。我國在這方面的研究還很少。由于許多疾病有著發(fā)病種族的差異性，對(duì)中國人自己的發(fā)病機(jī)制研究是必要的。盡管發(fā)病率低，但這類

6、疾病嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量，基因水平的研究有利于發(fā)病機(jī)制的研究，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育具有重大意義。 綜上原因，我們對(duì)短肢矮小進(jìn)行了臨床特征分析。在臨床特征分析的基礎(chǔ)上，對(duì)中國致密性骨發(fā)育障礙一家系和窒息性胸廓發(fā)育不良一家系共兩個(gè)家系進(jìn)行了基因突變的研究。 對(duì)象與方法： 1、對(duì)象 2005年1月—2008年3月年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科門診因身材矮小并短肢畸形而就診的患兒109例。年齡7個(gè)月～15歲，平均6

7、.7歲。入選標(biāo)準(zhǔn)為身高處于同年齡、同性別正常兒童生長(zhǎng)曲線第三百分位數(shù)以下或低于平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為矮小同時(shí)伴有短肢的患兒。對(duì)窒息性胸廓發(fā)育不良和致密性骨發(fā)育障礙家系分別進(jìn)行IFT80基因和CTSK基因突變分析。 2、方法 1.首先對(duì)所有收集的短肢矮小病例進(jìn)行臨床特征分析。然后進(jìn)行基因突變的研究。留取受試者外周靜脈血3—5ml(ATD先證者留取臍血)，采用酚—氯仿—異戊醇法提取基因組DNA。根據(jù)Genbank中人類IFT80

8、(intraflagellar transport protein，)基因序列，所有的編碼外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計(jì)引物，鄰近的Exon17—18設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier5.0軟件，由Invitrogen生物公司合成，各引物序列、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度及退火溫度詳見表1—1。根據(jù)Genbank中人類(Cathepsin K)基因序列及參考文獻(xiàn)[34]。對(duì)所有的編碼外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計(jì)5對(duì)引物。其中外

9、顯子3—4及6—7各設(shè)計(jì)一對(duì)引物。常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的片斷，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。對(duì)IFT80基因和CTSK基因的突變檢測(cè)采用DNA直接測(cè)序的方法：PCR產(chǎn)物純化后采用熒光素末端標(biāo)記法(BigDye TM Terminator)，經(jīng)ABI3730型全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用BLAST軟件與GenBanK中人類IFT80和CTSK基因序列比對(duì)。 結(jié)果： 1、通過對(duì)109例短肢矮小的臨床特征的

10、分析可以發(fā)現(xiàn)軟骨發(fā)育不全的發(fā)病率最高，占30％(33/109)，窒息性胸廓發(fā)育不良和致密性骨發(fā)育障礙發(fā)病率最低各占0.9％(1/109)。 2、骨齡異常占50.4％(55/109)；骨齡正常占49.6％(54/109)。 3、致密性骨發(fā)育障礙的先證者CTSK基因?yàn)榧兒闲訡/C突變核苷酸c．684(GenBank record： NM_000396)． A>C，導(dǎo)致蛋白p.Q187P的改變。 4、致密性骨發(fā)育障礙的

11、先證者父母CTSK基因在核苷酸c．684(GenBank record：NM_000396)為雜合性A/C突變。 5、在30例對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)CTSK基因存在該位點(diǎn)突變。 6、在窒息性胸廓發(fā)育不良的先證者中未發(fā)現(xiàn)IFT80基因的編碼區(qū)突變。 結(jié)論： 1、通過對(duì)短肢矮小的臨床特征分析可以提高對(duì)少見病的認(rèn)識(shí)。提高正確診斷率，減少誤診的發(fā)生。 2、通過對(duì)109例短肢矮小的臨床特征的分析發(fā)現(xiàn)軟骨發(fā)育不全的發(fā)

12、病率最高，占30％(33/109)，窒息性胸廓發(fā)育不良和致密性骨發(fā)育障礙發(fā)病率最低各占0.9％(1/109)。 3、骨齡異常占50.4％(55/109)；骨齡正常占49.6％(54/109)。骨齡評(píng)定對(duì)這類疾病的診斷價(jià)值有待進(jìn)一步的研究。 4、在中國致密性骨發(fā)育障礙的先證者中發(fā)現(xiàn)CTSK基因編碼區(qū)突變，先證者為純合性突變，其父母為雜合性突變。近親結(jié)婚增加了發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該避免近親結(jié)婚，降低發(fā)病率。 5.在1例中國窒