大豆GmNFYB1互作蛋白分析及與干旱相關(guān)下游基因分析.pdf

1、水分是大豆生長和發(fā)育過程中必不可少的重要元素之一，如果發(fā)生水分虧缺和干旱，會嚴重影響大豆生長，嚴重的干旱和其它非生物脅迫環(huán)境會造成大豆植株生長發(fā)育畸形，并導(dǎo)致大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究大豆抗旱機制，培育抗旱新品種，對大豆生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要支撐作用。
　　植物NFY轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)控植物生長發(fā)育、開花、抗旱、耐鹽堿的轉(zhuǎn)錄因子。NFY由A、B、C三個亞基家族組成，通過結(jié)合到CCAAT-box元件上調(diào)控下游基因的表

2、達，目前已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆等植物中克隆出多個參與植物抗逆反應(yīng)的NFYA、NFYB和NFYC家族基因。本實驗室前期研究表明過表達大豆GmNFYB1基因可以提高擬南芥和大豆的抗旱性，GmNFYB1基因與大豆抗旱密切相關(guān)，可能在大豆抗旱和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為進一步研究大豆GmNFYB1基因的調(diào)控機制，本文擴增克隆了大豆GmNFYB1基因以及大豆NFYA和NFYC家族基因，利用酵母雙雜交方法對大豆GmNFYB1與NFYA和NFYC家

3、族基因蛋白互作進行了分析。以轉(zhuǎn)GmNFYB1基因擬南芥為材料進行轉(zhuǎn)錄測序，根據(jù)測序結(jié)果選取了18個上調(diào)基因和13個下調(diào)基因進行定量PCR驗證，篩選獲得了GmNFYB1調(diào)控的部分下游基因，最后對獲得的下游基因和GmNFYB1蛋白進行凝膠組織分析。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對大豆21個NFYA家族基因和15個NFYC家族基因進行了生物信息學和進化樹分析，選出GmNFYC4、GmNFYC6、GmNFYC9和GmNFYA5

4、、GmNFYA16、GmNFYA19基因，對這6個基因進行啟動子元件和擬南芥同源基因功能分析，發(fā)現(xiàn)這6個基因均參與滲透、干旱、鹽及低溫脅迫等抗逆反應(yīng)。
　　(2)從大豆中擴增了GmNFYC4(690bp)、GmNFYC6(816bp)、GmNFYC9(732bp)、GmNFYA5(916bp)、GmNFYA16(618bp)、GmNFYA19(642bp)基因和GmNFYB1(444bp)基因。構(gòu)建了pGBKT7-GmNFYB1誘

5、餌表達載體和pGADT7-GmNFYC4、pGAD T7-GmNFYC6、pGADT7-GmNFYC、pGADT7-GmNFYA5、pGADT7-GmNFYA16、pGADT7-GmNFYA19表達載體。
　　(3)GmNFYB1自激活試驗證明GmNFYB1沒有自激活活性。通過酵母雙雜交試驗方法對GmNFYB1蛋白和GmNFYC4、GmNFYC6、GmNFYC9、GmNFYA5、GmNFYA16、GmNFYA19蛋白的互作進行分析

6、，發(fā)現(xiàn)GmNFYB1基因蛋白與GmNFYC4、GmNFYC6、GmNFYC9蛋白之間有互作關(guān)系，說明NFYB亞基和NFYC亞基之間存在互作關(guān)系。
　　(4)根據(jù)轉(zhuǎn)GmNFYB1基因擬南芥測序結(jié)果，選取參與抗旱反應(yīng)的18個上調(diào)表達基因和13個下調(diào)表達基因進行qRT-PCR分析，獲得了受GmNFYB1基因調(diào)控參與抗旱反應(yīng)的13個上調(diào)表達基因和7個下調(diào)表達基因。
　　(5)構(gòu)建了蛋白誘導(dǎo)表達載體PET-29b(+)-GmNFYB1