Spata1在雄性小鼠各組織中的表達及其與纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白IFT20的相互作用初探.pdf

1、目的:觀察SPATA1在雄性小鼠各組織中的表達及其在細胞內(nèi)的定位，并初步探討精子發(fā)生相關(guān)蛋白SPATA1與鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白IFT20是否存在直接的相互作用。
　　方法:提取成年雄性小鼠的心、腦、脾、肺、肝、腎、肌肉、睪丸8個組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR法觀察Spata1在各組織中的表達。以小鼠睪丸組織的cDNA作為模版，PCR擴增Spata1編碼區(qū)序列，分別構(gòu)建Spata1/pET-28a、Spata1/pEGFP-

2、N2和Spata1/pGADT7重組質(zhì)粒。利用Spata1/pET-28a重組質(zhì)粒進行蛋白誘導、純化后制備SPATA1抗體。提取小鼠8個組織及出生后不同時期的睪丸組織總蛋白，用Western-blot法觀察SPATA1蛋白在各組織及不同時期睪丸組織中的表達情況。將Spata1/pEGFP-N2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至COS-1細胞和APRE19細胞，提取COS-1細胞蛋白后用Western-blot法檢測融合蛋白的表達并觀察SPATA1-GF

3、P在APRE19細胞內(nèi)的定位。分離成年雄性小鼠睪丸的混合生精細胞，通過免疫熒光染色法觀察SPATA1在小鼠睪丸生精細胞中的定位。將Spata1/pGADT7與Ift20/pGBKT7進行酵母雙雜交實驗，檢測兩者之間是否存在直接的相互作用。用Western-blot法進一步檢測SPATA1蛋白在IFT20缺失小鼠睪丸組織內(nèi)的表達。
　　結(jié)果:PCR結(jié)果顯示Spata1在睪丸、腦組織中表達。Western-blot實驗發(fā)現(xiàn)，SPATA

4、1蛋白在小鼠睪丸、腦、心、腎組織均有表達，蛋白分子質(zhì)量為52kD。SPATA1蛋白在小鼠出生后24天開始表達，在出生后第30天開始表達豐富。SPATA1-GFP融合蛋白分子量為78kD，分布于APRE19細胞的細胞質(zhì)中。細胞免疫熒光實驗顯示SPATA1定位于精子細胞的頂體。酵母雙雜交實驗顯示SPATA1/IFT20混合質(zhì)粒在缺少三種氨基酸(Leu、Trp、His)的培養(yǎng)板上有菌落生成。SPATA1蛋白在條件敲除Ift20的小鼠睪丸組織內(nèi)