篩選dynamin-1在大鼠突觸小體中的相互作用蛋白.pdf

1、研究背景:
　　 在神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸襄泡循環(huán)是神經(jīng)元間信息傳遞的橋梁。突觸囊泡通過胞吐和胞吞作用完成一次突觸囊泡循環(huán)。有研究表明，癲癇患者神經(jīng)元突觸有明顯的功能異常，這種病態(tài)突觸通過突觸囊泡的快速循環(huán)再生使正常情況下每秒僅能傳播數(shù)次或數(shù)十次神經(jīng)沖動的突觸傳遞功能增加到每秒數(shù)十次到數(shù)百次，使癇樣放電得以迅速擴(kuò)布。由于突觸囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)是一個由多種蛋白質(zhì)介導(dǎo)的復(fù)雜過程，并在多個環(huán)節(jié)受到精確調(diào)控，因此，越來越多的研究集中于參與該過程

2、的蛋白質(zhì)及其相互間的作用。
　　 Dynamin-1（又稱發(fā)動蛋白-1），是一種G蛋白，為三磷酸鳥苷酶(GTPase)家族的一員，由四個功能結(jié)構(gòu)域組成，分別為N末端GTPase域、普列克底物蛋白同源域(pleckstrinHomologydomain，PH)、GTPase效應(yīng)者結(jié)構(gòu)域(GTPaseeffectordomain，GED)和C末端脯氨酸和精氨酸富集域(proline-andarginine-richdomain，PR

3、D)。與家族其它成員DynaminⅡ、Ⅲ不同，dynamin-1只在腦、神經(jīng)元突觸連接部位及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中特異性表達(dá)，是一種突觸前膜蛋白。目前大量研究證明，dynamin-1在突觸囊泡循環(huán)及囊泡在高爾基體中的運輸中發(fā)揮重要作用。因此，對dynamin-l相關(guān)作用蛋白的研究，有利于探討dynamin-1在突觸囊泡循環(huán)中的作用機(jī)制，為臨床治療癲癇尋找一個有效的靶點。
　　 研究目的:
　　 利用分子克隆技術(shù)、GSTPull

4、-down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，研究dynamin-1各個結(jié)構(gòu)功能域的相互作用蛋白，以探討dynamin-1在突觸囊泡循環(huán)中的作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 本實驗先用分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建dynamin-14個功能域的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-PH、pGEX-4T-2-PRD、pGEX-4T-2-GED、pGEX-4T-2-GTPase，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及谷胱甘肽瓊脂糖凝脂純化柱對4個重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)與純化

5、得到4個融合蛋白GST-PH、GST-PRD、GST-GED、GST-GTPase。然后利用GSTpull-down技術(shù)分別將這4個融合蛋白與分離提取的大鼠腦突觸小體進(jìn)行蛋白間的相互作用，并進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析鑒定。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建了pGEX-4T-2-PH、pGEX-4T-2-PRD、pGEX-4T-2-GED、pGEX-4T-2-GTPase這4個表達(dá)質(zhì)粒；這4個表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌E.coliBL21(

6、DE3)中高效表達(dá)的條件為:25℃、1mmol/LIPTG、誘導(dǎo)表達(dá)4h，通過GlutathioneSepharose4B親和層析柱分別純化得到了高純度的融合蛋白。
　　 2.成功分離了大鼠腦神經(jīng)突觸小體，經(jīng)pulldown技術(shù)聯(lián)合LC-MS質(zhì)譜分析，鑒定了在大鼠神經(jīng)突觸小體中與dynamin-1有相互作用的蛋白共35個。
　　 結(jié)論:
　　 本實驗通過GSTpulldown技術(shù)共獲得在大鼠神經(jīng)突觸小體中與dyn