番茄CAT基因的克隆及其編碼蛋白與PVY HC-Pro蛋白的互作研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是流行于全世界的一種寄生范圍很廣的病毒，它能危害多種經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物以及果樹、藥材和牧草等，給我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大的損失。PVY壞死株系侵染番茄（Solanum lycopersicum）可引起寄主葉脈壞死癥狀，給番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)造成重大危害。而在我國番茄病毒病的研究多集中在煙草花葉病毒TMV和黃瓜花葉病毒CMV上，關(guān)于番茄上PVY病毒的研究甚少報道。因此，本研究以番茄和PVY壞

2、死株系（PVYN）為主要研究材料，利用PVYN病毒的沉默抑制子（HC-Pro）與CAT基因家族互作的關(guān)聯(lián)性作為研究的切入點，通過蛋白質(zhì)互作技術(shù)深入解析HC-Pro蛋白和番茄兩個CAT蛋白在PVYN致病過程中互作的關(guān)聯(lián)性。本實驗的內(nèi)容包括以下幾個部分：
　?。?）同源克隆法獲得番茄兩個 CAT蛋白編碼的基因 ORF全長，CAT1(Genbank登錄號：KU933832)，CAT2(Genbank登錄號：KU933833)，均包含14

3、79nt核苷酸，編碼492個氨基酸。NCBI在線BLAST比對顯示CAT1和CAT2基因之間的相似性為73％。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，兩蛋白的編碼基因與茄科作物CAT蛋白的編碼基因具有很高的相似性，歸為一簇。
　　（2）將CAT1和CAT2基因構(gòu)建到酵母雙雜誘餌載體PGBKT7，將HC-pro基因構(gòu)建到捕獲載體PGADT7載體上，透過篩選獲得重組質(zhì)粒BD-CAT1、BD-CAT2和AD-HC。將AD-HC分別與BD-CAT1、BD

4、-CAT2共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并通過酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid，Y2H）驗證HC-Pro蛋白與兩個CAT基因編碼蛋白的互作情況。結(jié)果表明：CAT1蛋白與HC-pro蛋白不存在互作；而CAT2蛋白與HC-pro蛋白存在互作。
　　（3）將CAT1、CAT2基因及HC-pro基因與PGWCm載體連接，構(gòu)建BiFC入門載體，經(jīng)過LR反應(yīng)將 CAT1基因、CAT2基因和HC-pro基因分別轉(zhuǎn)移到 pEarleyGate2

5、02(YN)和pEarleyGate201(YC)上，得到重組質(zhì)粒 YC-HC、YN-CAT1、YN-CAT2。將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌，將含有YC-HC農(nóng)桿菌分別與含有YN-CAT1、YN-CAT2的農(nóng)桿菌混合并轉(zhuǎn)染煙草葉片細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察HC-Pro蛋白分別與CAT1、CAT2蛋白的互作情況。結(jié)果顯示，CAT1蛋白與HC-pro蛋白不存在互作；CAT2蛋白與HC-pro蛋白在細(xì)胞膜上互作。
　　酵母雙雜交（